化疗是恶性肿瘤临床治疗的常用方法之一，而多数化疗药易引起患者骨髓抑制使患者血小板减少，临床上为提高患者耐受常预防性或治疗性地输注血小板。然而，多数研究[1-2]表明血小板活化后释放的细胞因子能促进肿瘤新生血管形成，最终促进肿瘤的生长和转移，使患者预后较差。tumstatin是一种近些年发现的内源性血管生成抑制因子，可通过功能性受体特异性地诱导血管内皮细胞凋亡、抑制其增殖，降低了新生血管的生成，从而使肿瘤生长得到抑制[3]。该研究在携带tumstatin基因的慢病毒转导CD34+细胞经体外扩增培养后生成有抗血管生成作用的巨核细胞/血小板[4]和非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(non-obese diabetic/server combined immune-deficiency, NOD/SCID)鼠体内产生有抑制血管形成且保持正常聚集功能的血小板研究基础上[5]，建立NOD/SCID小鼠A549细胞肺腺癌移植瘤模型, 体内研究tumstatin转基因巨核细胞联合化疗药GEM对肿瘤的抑制作用和小鼠生存率的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 NOD/SCID鼠24只, ♀, 体质量(19±1) g, 清洁级,购自上海斯莱克实验动物有限公司。A549肺腺癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞中心。NK细胞抑制剂anti-asialo GM1购自美国BioLegend公司；GEM购自江苏豪森药业股份有限公司；鼠抗人CD31 mAb购自北京中杉金桥生物技术有限公司；巨核细胞体外诱导培养基购自加拿大STEMCELL公司；CD34磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司；tumstatin转基因巨核细胞由安徽省立医院输血科细胞培养室制备。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞培养 肺腺癌A549细胞培养于含100 ml/L胎牛血清、1×105 U/L链霉素和1×105 U/L青霉素的RPMI-1640培养液中, 在37 ℃、50 ml/L CO2培养箱内常规传代培养。

竹林年龄结构为3度竹以下，其中3度竹留20%，2度竹和1度竹各留40%，立竹量在140～180株/667 m2，竹子眉径一般为7～9 cm，最大不能超过11 cm。竹子全部钩梢，留存盘数12～15盘左右，第1档开枝越低越好。材用林改造初期，由于竹子眉径大、竹子高，钩梢时留存盘数在15～17档为好，立竹量可适当减少10～15株/667 m2。区块内留竹不宜过度均匀，最好预留2～3个面积在3 m2以上的空档地带，以便透光通气。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件分析，实验所得数据以表示。两组间比较用非配对t检验，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，生长曲线用线性回归分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

目前,已发现的具有物理意义的非线性发展方程有几百种,各个学科还在涌现新的方程,不少学者对这些新方程非常感兴趣,发现了大量的求解非线性偏微分方程的方法,主要有逆散射法[1]、Bäcklund法[2]、Darboux变换法[3]、Hirota双线性法[4-5]、Painlevé展开法[6]等.利用数学软件MATLAB和MAPLE等,学者们又发现了许多求解非线性偏微分方程的新方法,如双曲函数法[7]、齐次平衡法[8]、Jacobi椭圆函数展开法[9]、包络变换法[10-11]、ADM法[12]和F展开法[13]等.本文对F展开法进行扩展,扩展后的方法可以求得非线性偏微分方程更丰富的解.

1.2.6 SP免疫组织化学染色 取肿瘤蜡块，3 μm切片, 二甲苯脱蜡, 梯度酒精脱水，常规免疫组化步骤，微血管密度(microvessel density,MVD)计数参照Weidner法[8]: ① 以血管内皮细胞染成棕黄色或棕色为CD31阳性； ② 切片在100倍光学显微镜下观察MVD最高区域, 200倍光学显微镜下选择不重复视野计数十个视野CD31阳性的微血管数, 取平均值作为MVD。

平面QRS-T夹角是指额面QRS波群电轴(QRS wave axis,QRSaxis)和T波电轴(T wave axis,Taxis)之间的夹角,其大小等于QRS波电轴和T波电轴差值的绝对值。如绝对值>180°,则平面QRS-T夹角=360°-|QRSaxis-Taxis|。

1.2.4 评估抗肿瘤活性 通过监测肿瘤生长速率评估抗肿瘤活性，并使用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤大小用二维尺度测定，用下式计算：肿瘤体积=π/6×(长径×短径2)，取肿瘤体积平均值，绘制肿瘤生长曲线。抑瘤率以T/C值进行计算。T/C值是抗肿瘤功效的重要指标，T/C值<0.42，认为有效[7]。

1.2.2 tumstatin转基因巨核细胞的制备 参照文献[4]，从新生儿脐带血中分离单个核细胞，用免疫磁珠法筛选CD34+细胞，用携带tumstatin的慢病毒转染CD34+细胞，用STEMCELL无血清培养基，在前面实验的基础上选用STEMCELL扩增效率更高的组合细胞因子在37 ℃、50 ml/L CO2培养箱内常规传代培养，培养1周后计算转染效率。以表达ZsGreen 绿色荧光的细胞为转染阳性细胞，统计同一视野下转染阳性细胞数和总细胞数；转染效率=ZsGreen 阳性细胞数/总细胞数×100%。CD41a是巨核细胞和血小板的特异性抗体，在体外扩增第11天流式分析CD34-CD41a+的表达，将培养细胞进行涂片并瑞氏染色观察细胞形态。输注到小鼠体内的巨核细胞均为体外扩增培养11～15 d的巨核细胞。

（3）实施特殊作业环节的专人负责制度。对下套管、固井、挂尾管等特殊作业环节增派有丰富现场经验的专家进行驻井负责，缩短问题反馈时间，增强突发问题的处理能力。

1.2.3 肺腺癌模型的制作及给药 取对数生长的A549细胞, 计数1×106的细胞悬浮于0.2 ml生理盐水中皮下注射到小鼠背部，植入后约第45天提取肿瘤，去除坏死组织和非癌组织后，将癌细胞癌组织切成大小约2 mm× 2 mm的小块悬浮于生理盐水中，以0.2 ml/只皮下注射到NOD/SCID小鼠背部。待瘤体直径大于5 mm[6]以后将小鼠随机分为4组(每组6只)：生理盐水对照组(A组，对照组)、GEM化疗组(B组，单纯化疗组)、GEM联合巨核细胞组(C组)、GEM联合tumstatin转基因巨核细胞组(D组)；其中B、C、D三组为治疗组。各治疗组第1、3、5天腹腔注射60 mg/g的GEM，第2、4、6天C、D组分别经尾静脉注射巨核细胞和tumstatin转基因修饰巨核细胞5×105/只，输注巨核细胞同时输注20 μl asialo GM1 抗血清(自然杀伤细胞抑制剂)，生理盐水对照组每天注射等量的生理盐水，上述6 d 为一个疗程， 给药4个疗程，共24 d 。治疗期间，每3 d 测量1次肿瘤体积和小鼠质量，绘制肿瘤生长曲线。在治疗的第15天对各组活着的小鼠眼眶取血0.5 ml,用希森美康xs-800i血细胞分析仪进行分析。治疗第24天小鼠以颈椎脱臼法处死, 剥离出瘤体, 剔除多余的结缔组织, 测量瘤体的长径和短径并称重,以40 g/L甲醛溶液固定瘤体, 石蜡包埋, 以3 μm厚度连续切片。治疗期间记录小鼠生存情况，绘制各组小鼠生存曲线。

2 结果

2.1 tumstatin转基因巨核细胞 慢病毒感染的CD34+造血干细胞荧光显微镜分析、计算得出细胞转染阳性率为91.2%。流式分析显示在体外扩增第11天，CD34-CD41a+达到62.3%。瑞氏染色形态学分析显示tumstatin转基因细胞呈现出典型的巨核细胞形态，胞质内充满大小不等的紫红色颗粒或血小板，细胞周围可见有血小板堆集；表明转基因的表达并不影响CD34+细胞诱导分化为巨核细胞和血小板，见图1。

从图3B可以看出，治疗组3组中只有GEM联合tumstatin转基因巨核细胞组在20 d 以后T/C值<0.42，显示出良好的疗效。 相比之下，化疗组和非转基因巨核细胞联合组显示的T/C值在大多数时间点远远超过0.42，表明疗效相对较差。

图1 绿色荧光蛋白ZsGreen在转染细胞的表达及CD34+诱导分化巨核细胞流式图和形态学鉴定图

A：转染并换液72 h后光学显微镜观察结果×100；B：换液后72 h荧光显微镜下观察转染结果×100；C：转染后细胞第11天CD34和CD41a表达率；D：转染后的巨核细胞和血小板×1 000

2.2 联合治疗对肺腺癌皮下肿瘤的抑制作用 给药前，游标卡尺测量并计算出的各组肺腺癌小鼠皮下移植瘤体积大小无明显差异。经腹腔和尾静脉给予GEM和转基因、非转基因巨核细胞以后, 治疗组较对照组均出现不同程度的抑制作用，见图2，生长曲线表明生理盐水对照组在24 d 内显示出连续的肿瘤体积增加，第15天以后出现快速生长，对各组生长曲线进行回归分析发现A组生长最快(生长速率k=0.010 57 cm3 /d)，见图3A。GEM组(生长速率k=0.004 626 cm3/d)和GEM联合巨核细胞组(生长速率k=0.006 244 mm3/d)皮下肿瘤生长到18 d和24 d，显示出相对缓慢的回归，但前期作用不明显，而GEM联合tumstatin转基因巨核细胞组(生长速率=0.002 589 cm3/d)显示出持续的肿瘤体积抑制达24 d ，表明更高更稳定的疗效。

刚体运动主要包括CT检查中出现的头部、颈部的转动或运动，以及床体的移动。刚体运动导致的图像伪影主要表现为图像轮廓伪影、移动条状伪影、低密度影像等。

1.2.5 HE染色 取肿瘤蜡块，低温处理后以最大面积做3 μm厚度切片, 苏木精—伊红(HE)染色法处理后，在100倍光学显微镜下寻找坏死面积最高区域, 200倍光学显微镜下随机选3个视野进行拍照, 观察肿瘤组织坏死情况。

图2 小鼠给药前和给药后肿瘤大小

2.3 联合治疗提高血细胞值及单纯化疗小鼠生存率 GEM给药前，各组小鼠的体质量均为(19±1)g，毛发平顺，活动能力(攀爬、移动)强，给药1周后开始出现体重下降、毛发勃起、活动力减弱、脱毛，其中单纯化疗组脱毛和体重减轻最明显,而生理盐水组小鼠体质量、毛发等并无明显变化。给药15 d 后眼眶取的血用血细胞分析仪进行分析发现，B组外周血中三系细胞显著减少，血小板远低于A组(P<0.01)。C、D组的白细胞远高于A组，血小板较未添加巨核细胞的B组有明显提高(P<0.01)，而红细胞略低于生理盐水组，见表1，在给药18 d时B组小鼠全部死亡，D组还有部分存活，见图3，对比单纯化疗组小鼠的生存率得到显著提高(P<0.05)。

表1 第15天小鼠血细胞值

组别n红细胞(×1012)白细胞(×109)血小板(×109)A组68.540±0.035 2.270±0.217 1017.00±75.60B组46.010±0.107**0.195±0.034**248.50±2.89**C组57.770±0.1474.160±0.1541196.80±46.34##D组58.066±0.68811.302±1.1991297.00±41.20##

与A组比较：**P<0.01；与B组比较：##P<0.01

图3 小鼠皮下肿瘤的生长曲线、T/C值和生存曲线

A：各组小鼠肺腺癌皮下瘤生长曲线；B：各治疗组肿瘤体积与对照组肿瘤体积的比值(T/C)；C：各组小鼠的生存曲线；与A组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.4 联合化疗对肺腺癌小鼠肿瘤组织坏死的影响 处死小鼠后取出瘤体进行HE染色, 结果显示, 对照组皮下瘤组织以轻、中度坏死为主, 治疗组以中、重度坏死为主, 细胞核萎缩、变形及破碎, 细胞排列稀疏, 以胞质着粉红色及紫色为主, 肿瘤坏死程度高于生理盐水组； 其中化疗组和巨核细胞联合化疗组以中度坏死为主, 坏死程度略高于对照组，而tumstatin转基因巨核细胞联合化疗组以重度坏死为主，坏死程度高于其他3组。见图4。

图4 各给药组小鼠瘤体坏死情况 HE×200

A:生理盐水对照组；B:GEM化疗组(第18天)；C:GEM联合巨核细胞组；D:GEM联合tumstatin转基因巨核细胞组

2.5 联合化疗对肺腺癌小鼠肿瘤微血管形成的影响 免疫组织化学测定给药24 d后的各组移植瘤小鼠皮下MVD(化疗组取第18天肿瘤组织), 结果表明, 生理盐水组肿瘤组织微血管新生最为明显, 治疗组MVD均低于生理盐水对照组，其中tumstatin转基因巨核细胞联合化疗组的MVD最低， 其次为GEM化疗组(18 d)和巨核细胞联合化疗组, 与生理盐水对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 且tumstatin转基因巨核细胞联合化疗组肿瘤微血管新生抑制作用最明显，见图5。

3 讨论

恶性肿瘤如肺癌，发病率逐年增加，严重威胁人类健康，化疗是其临床治疗的常用方法之一。但多数化疗药像卡铂、紫杉醇、GEM等药物会造成骨髓抑制，导致不同程度的血小板减少，限制了临床化疗药物的剂量和应用。目前，临床上主要采取直接血小板输注进行临床治疗，而血小板对肿瘤生长和转移具有强烈的促进作用，常引起预后不良[1-2]。

图5 各组小鼠肺腺癌微血管生长情况 ×200

A:生理盐水对照组；B:GEM化疗组(第18天)；C:GEM联合巨核细胞组；D:GEM联合tumstatin转基因巨核细胞组；E:各组小鼠瘤体的MVD；与生理盐水对照组比较：**P<0.01

已知肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，当肿瘤直径达到1～2 mm时，血管生成对维持肿瘤生长至关重要[9]。研究[10-11]表明，血管生成调节蛋白大部分被证实贮存在血小板α-颗粒，生理或病理条件下血小板活化释放多种血管生成调节因子参与调节血管生成，其中促进因子持续地占有主导地位。为此，笔者设想通过携带相关基因的慢病毒转导巨核细胞/血小板前体细胞，经扩增培养生成具有抗血管生成作用的血小板，利用其靶向作用在肿瘤部位释放血管生成抑制因子治疗肿瘤。

tumstatin是来源基底膜Ⅳ型胶原α3链C末端非胶原区的内源性新生血管生成抑制因子，分子量为30.54 ku，主要经过MMP-9降解基膜的Ⅳ型胶原α3链产生，体内外实验证明tumstatin是通过特异性结合肿瘤血管内皮细胞表面上调的αvβ3整合素受体(主要是β3)，抑制内皮细胞蛋白质合成，最终抑制肿瘤生长和转移，其抗血管生成能力至少是endostatin的10倍[12]。本研究用tumstatin基因修饰造血干细胞CD34+细胞，在巨核细胞/血小板特异的GpIbα启动子作用下靶向表达tumstatin，以A549肺腺癌细胞接种较少发生排斥反应及移植物抗宿主病的NOD/SCID小鼠建立的肺腺癌异位移植瘤模型为研究对象。在对小鼠肺腺癌治疗过程中连续用化疗药物GEM作用于肿瘤细胞，主动抑制血小板产生，然后输注基因修饰的巨核细胞，血小板在体内产生并在肿瘤部位活化，释放目标蛋白，从而达到抗血管生成和化疗的联合作用。结果表明，单纯输注化疗药显著抑制了小鼠血小板和各项血细胞的产生，而输注基因修饰的巨核细胞提高了小鼠血小板水平，提高了小鼠生存率，但还是存在一定的排斥反应，白细胞较对照组升高很多。MVD的测定结果表明tumstatin转基因巨核细胞有很高的抗肿瘤血管新生的作用，这也可能是tumstatin抑制了内皮细胞蛋白质合成,使内皮细胞的凋亡增加从而使肿瘤生长得到抑制。该方法在一定程度上解决了化疗药物的使用引起的患者血小板减少症和血小板的输注引起的肿瘤新血管生成增加的弊端，具有基因治疗的优势(如肿瘤治疗针对性强，靶向性高和非细胞毒性等)。另外，基因修饰的巨核细胞在体内不能永久生存，因此转基因巨核细胞的输注引起人体基因突变概率低，这使基因治疗联合化疗在发挥更大的抗肿瘤效果的同时减少了出现不良反应的可能。而对肿瘤细胞具有目标特异性的血小板若采用患者自身分离培养的携带目的蛋白作为输送载体的血小板，可以有效避免机体的免疫排斥反应，具有更高的安全性。同时本研究有一定局限性，选择的GEM的肿瘤杀伤作用不强，但高度抑制骨髓造血，使小鼠过早死亡，影响了肿瘤转移的研究，因此tumstatin基因和GEM对抑制肿瘤转移的作用有待进一步研究。

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