骨关节炎 (osteoarthritis, OA) 是一种以关节软骨的变性为主要特征的关节退行性疾病。OA发病率、致残率高，给社会和家庭带来沉重负担。OA的软骨退变机制复杂，在软骨细胞中线粒体不仅为细胞产生能量，而且介导其他关键的生物学行为，它可从细胞自噬、老化、细胞死亡等多个方面影响OA发生发展[1-2]。线粒体功能失调严重影响软骨细胞存活，线粒体受损是OA发病的关键环节[3-4]。受损线粒体主要通过线粒体自噬(mitophagy)降解，因此mitophagy成为保持线粒体的数量及质量稳定，维持软骨细胞内环境稳态及存活重要调节机制[5]。另外mitophagy可降低OA治病因子活性氧 (reactive oxygen species, ROS)的产生和炎症因子的激活[6-7]。但是目前mitophagy在OA病程中的作用机制尚未明确，所以本研究通过环孢素A (cyclosporin A, CsA)抑制软骨细胞mitophagy，观察对OA相关蛋白基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)表达的影响，从而深入探讨mitophagy在OA中的作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料 所用软骨来自安徽医科大学第一附属医院在2016年10月～2017年6月接受全膝关节置换手术的患者，所有患者均符合OA的诊断标准[8]。取术中截取的关节软骨标本放入盛有生理盐水的无菌盒中，送往实验室处理。

首先，要合理规避承包风险，建立健全风险投资基金。因为特色乡村建设涉及的资金量大、见效慢，业主和施工方容易产生资金链短缺，形成烂尾工程。必要的风投基金，可能会产生杠杆作用。同时，要签订严密的施工合同，严格执行合同运行机制，只有在施工中加强合同管理，才能保证合同造价的合法性，减少业主和总承包商不必要的纠纷，有效地控制工程造价。

1.2 主要试剂与药物 Ⅱ型胶原蛋白抗体(英国 Abcam 公司)；鼠源抗 GAPDH 单克隆抗体(美国Proteintech Group公司)；MMP-1、Tom20抗体(万类生物科技公司)；MMP-13抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)； 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；MMP-1、 MMP-13、GAPDH引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)；Lysotracker (美国Life Technologies 公司)；Mitotracker、TRIzol 试剂( 美国Invitrogen公司)；CsA(美国MedChemExpress公司)；PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)。

1.3 方法

1.3.5 Western blot法检测蛋白表达 处理细胞后提取各组细胞总蛋白，应用BCA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白样品与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)4 ∶1混合，经水浴锅煮沸使蛋白变性，将适量各组蛋白进行SDS-PAGE电泳后用电转仪转移至 PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，将载有蛋白的PVDF膜移入有一定比例稀释好一抗的孵育盒中，一抗稀释比例分别为MMP-13(1 ∶100)、MMP-1(1 ∶500)和Tom20(1 ∶500)，4 ℃过夜，TBST洗膜后加入稀释好的二抗室温孵育2 h，配ECL工作液，凝胶成像仪中显影。

1.3.2 软骨细胞鉴定 在24孔板中用玻片进行细胞爬片，分别进行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色。① 甲苯胺蓝染色：倾去培养基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，去除甲醛再以PBS洗3次， 1%甲苯胺蓝染色30 min后PBS洗3次，取出爬片在倒置光镜下观察拍照。② Ⅱ型胶原免疫荧光染色：用上述同样方法固定细胞，0.5%Triton X-100室温通透20 min，PBS洗3次，滴加正常山羊血清室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，滴加Ⅱ型胶原抗体(1 ∶400)，湿盒中4 ℃孵育过夜；37 ℃复温30 min，PBS洗3次，加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC) 标记的二抗(1 ∶100)，湿盒中37 ℃避光孵1 h，PBS洗3次，用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察采集图像。

2.1 软骨细胞鉴定结果 甲苯胺兰染色：培养的细胞经染色后呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒，说明所培养细胞可合成蛋白聚糖(图1A)。Ⅱ 型胶原免疫荧光染色：可见所有细胞胞质和胞膜呈鲜亮的绿色荧光，细胞核区域未见明显绿色荧光，证明所培养细胞可合成Ⅱ型胶原蛋白(图1B-D)。Ⅱ型胶原蛋白与蛋白聚糖是软骨细胞标志性分泌物，两种染色均证明本实验所培养的细胞均为软骨细胞。

2.3 各组细胞MMP-1、MMP-13的mRNA表达Real-time PCR结果显示：与空白对照组比较，IL-1β组、IL-1β+CsA组的MMP-1、MMP-13的mRNA表达量均显著增高(P<0.01)，与IL-1β组比较，IL-1β+CsA组MMP-1、 MMP-13的mRNA表达量显著高于IL-1β组(P<0.01)。各组间比较差异有统计学意义(F=715.22，P<0.01；F=617.49，P<0.01)，见图3。

1.4 统计学处理 使用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验数据均以表示， 多组间比较采用方差分析(ANOVA)，两组之间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 LTG、MTR 双色荧光探针染色检测mitophagy MTR是一种线粒体的红色荧光探针，用于活细胞线粒体的特异性荧光染色，LTG是一种自噬体的绿色荧光探针，用于细胞内自噬体的荧光染色，两者进行荧光共定位可以检测mitophagy的发生情况。在荧光显微镜下MTR将线粒体标记为红色，LTG将自噬体标记为绿色，自噬体与线粒体共定位时显现为黄色标记。在对照组几乎无明显的黄色标记, IL-1β组可见大量的黄色标记，而IL-1β+CsA组只有少量黄色标记，见图2。

1.3.1 原代软骨细胞分离、培养及分组 在超净工作台用手术刀片将软骨削成薄片，用含有双抗的PBS洗3遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织粒，移入离心管中离心弃上清液，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶37 ℃恒温消化0.5 h，离心弃去胰蛋白酶液体 , 加入含血清的培养液中止胰蛋白酶消化；弃上清液，加入2倍体积的0.1 % Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化8～12 h。先以500 r/min离心5 min，此时消化下来的细胞悬浮在上清液中，取上清液，再以1 500 r/min离心5 min，沉淀细胞用含有10% FBS的DMEM培养基重悬转入培养瓶中常规培养，剩余软骨再加入2倍体积的0.1% Ⅱ型胶原酶37 ℃继续消化8～12 h，以同样方法收集细胞直至所有软骨全部消化。待贴壁细胞融合率达到80%左右时，弃掉培养基，加入0.25%胰蛋白酶消化，按比例进行传代培养。本实验均使用第二代软骨细胞并分为3组:空白对照组、IL-1β(10 ng/ml)组、IL-1β(10 ng/ml)+ CsA (5 μmol/L)组,待细胞融合至60%～80%时给予干预处理 24 h。

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1.3.4 Real-time PCR测定mRNA的表达 分别采用TRIzol 法提取各组细胞总RNA，测量浓度后用逆转录试剂盒获取RT反应液进行PCR反应，根据TaKaRa试剂盒说明书配20 μl反应体系，所用引物序列如下GAPDH：F: 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，R:5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′；MMP-1：F: 5′-AAATAGTGGCCCAGTGGTTG-3′，R:5′- CACATCAGGCACTCCACATC-3′；MMP-13：F: 5′-GACT- TCCCAGGAATTGGTGA-3′，R:5′-TGACGCGAACAA-TACGGTTA-3′，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃引物退火5 s，60 ℃延伸反应34 s，共进行40个循环，离解阶段温度设置为：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。反应终止后根据所测Ct值，用2-ΔΔct法计算出mRNA的相对表达量。

2 结果

1.3.3 MTR和LTG荧光探针染色 在24孔板中培养各组细胞，吸除培养液，加入37 ℃预热的Mito Tracker Deep Red(100 nmol/L)工作液染色，37 ℃孵育20 min。吸除染液，加入37 ℃预热的Lysotracker Green(75 nmol/L)工作液。37 ℃孵育1.5 h，使用PBS替换上述染色液，置于荧光显微镜下观察。

图1 软骨细胞鉴定

A:甲苯胺蓝染色×200; B-D:Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色(B图为Ⅱ胶原免疫荧光，C图为DAPI荧光染色，D图为 B、C 组合图)×400

图2 免疫荧光共定位检测mitophagy的表达 ×400

A:对照组；B: IL-1β组；C: IL-1β+ CsA组；1: LTG染色；2：MTR染色；3为 1、2 组合图

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图3 MMP-1、MMP-13 mRNA在软骨细胞中的表达

与对照组比较：**P<0.01;与IL-1β组比较：##P<0.01

2.4 各组细胞MMP-1、MMP-13和Tom20蛋白表达量 Western blot结果显示与空白对照组比较，IL-1β组、IL-1β+ CsA组的 MMP-1、MMP-13蛋白表达量均显著增高(P<0.05)；与IL-1β组比较，IL-1β+ CsA组MMP-1、MMP-13蛋白表达量显著高于IL-1β组(P<0.05)，各组间比较差异有统计学意义(F=13.48，P<0.01；F=16.45，P<0.01)；同时与空白对照组比较，IL-1β组Tom20蛋白表达量显著降低(P<0.05)；而与IL-1β组比较，IL-1β+ CsA组Tom20蛋白表达量显著增高(P<0.05)，见图4。

图4 MMP-1、MMP-13和Tom20蛋白在软骨细胞中的表达

与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01;与IL-1β组比较：#P<0.05

3 讨论

OA的发病机制并未完全明确，可能与生物力学改变、软骨细胞老化、细胞内自由基、金属蛋白酶降解等相关。基质金属蛋白酶在OA的滑膜、 软骨组织均可产生，可降解软骨基质致软骨破坏，也是众多细胞因子作用的重要环节。其中MMP-1在正常软骨中则很少表达，而在OA软骨中的表达明显升高。MMP-1可作用于Gly906-Leu907的肽键，从而裂解软骨基质的主要成分Ⅱ型胶原蛋白，从而促进OA软骨的退变。与MMP-1同属于胶原酶的MMP-13不仅可与MMP-1作用相同的位点裂解Ⅱ型胶原蛋白，而且可对裂解之后的Ⅱ型胶原小片段进行二次裂解。在众多基质金属蛋白酶亚型中，MMP-13是最有效的Ⅱ型胶原降解酶，其降解速率可达到MMP-1的十倍之多，与OA相关性较高[9]。在众多促炎因子中，IL-1β在启动和促进OA进展中具有重要作用。IL-1β不仅可通过上调可诱导一氧化氮合酶与环氧化酶2进而促进一氧化氮、前列腺素E2 的分泌[10]，而且可促进基质金属蛋白酶分泌参与OA发生发展。在本研究中，采用IL-1β刺激OA软骨细胞MMP-1、MMP-13表达增多，这与Santangeol et al[11]干预结果相一致。

首先，将项目拆分成几个大问题。例如“癌症”项目的大问题包括：“癌症的成因”“癌症的预防与治疗”“免疫系统如何对抗癌细胞”等；接着，确定中问题，中问题是直接与教学单元相关的，与教学目标相对应。例如，“癌症”项目的中问题有“生物变异的类型”“免疫系统的三道防线”“动物的细胞培养和克隆形成”等；然后再确定小问题甚至更小的问题，小问题的完成有助于完成中问题。例如，“癌症”项目中的小问题有“基因突变的特点和类型”“基因重组的类型”“细胞免疫作用的对象和免疫过程”“什么是细胞株”“克隆培养法”等。在此基础上，再指导学生利用该项目的思维导图将所学的相关知识联系起来，从而构建知识网络(图2)。

OA病理上可累及整个关节内所有组织，关节软骨细胞则处在一个低氧、炎症刺激的微环境中，炎症的激活和低氧均可损伤线粒体，受损线粒体主要通过特异性的标记蛋白迁移并形成自噬体，最终与溶酶体融合降解，这个过程称为mitophagy[5,12]。mitophagy机制并未完全明确，但是研究[13-14]表明受损的线粒体可通过线粒体通透性转换使线粒体去极化，从而与自噬体融合发生mitophagy。CsA能与位于线粒体基质空间中亲环蛋白D结合从而特异性的抑制线粒体通透性转换从而减少mitophagy的发生。Tom20为线粒体外膜蛋白受体，定位于线粒体上稳定表达，当mitophagy发生增多时表达降低。本研究结果显示当OA软骨细胞受IL-1β刺激之后，LTG、MTR荧光染色共定位明显增多，Tom20蛋白减少，说明软骨细胞内mitophagy发生增加。在正常状态下，细胞内基础性mitophagy水平很低，起到了维持细胞内稳态的作用，但在IL-1β刺激下，线粒体受损增多，mitophagy会增强以清除受损线粒体保护细胞免受损伤。而当加有mitophagy抑制剂CsA后，LTG、MTR荧光染色共定位相对IL-1β组减少，Tom20蛋白也相对增加，说明mitophagy被抑制，但MMP-1、MMP-13表达进一步增多，提示抑制OA软骨细胞mitophagy可使MMP-1、MMP-13表达上调，进一步促进OA的发展。

受损的线粒体可介导细胞程序性死亡，mitophagy通过清除受损的线粒体使其选择性的隔离和降解，防止进一步的损伤，维持细胞内环境稳定，mitophagy功能障碍与多种老龄化病变相关[15]。因此，笔者推测抑制mitophagy的发生使受损的线粒体无法有效的清除，致使受损线粒体堆积并继续产生大量活性氧、炎症因子激活、细胞色素C等对软骨细胞有害的物质，进一步促进MMP-1和MMP-13表达。本研究初步揭示软骨细胞中mitophagy的抑制可增加OA相关蛋白MMP-1和MMP-13表达，说明mitophagy在OA进展中有一定保护作用，但具体分子机制及作用途径并不明了，而且本研究为体外实验，对于复杂多变的体内环境有待进一步探索。

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