颅脑损伤是一种常见病、多发病，其后遗症一直是危害人类健康的主要因素之一，其中颅脑创伤后认知功能障碍对患者的生活质量产生重要的影响，且认知功能障碍是颅脑损伤后最持久、最严重的并发症之一[1]。近年来，大量研究[2]显示颅脑损伤后出现神经细胞凋亡，从而出现认知及学习记忆功能障碍。目前，国内外研究对颅脑创伤后神经细胞凋亡以及认知功能障碍的确切机制尚无完全揭示。因此，该研究利用Marmarou方法构建闭合性颅脑损伤模型，采用实时定量荧光PCR、免疫组织化学、原位末端标记技术法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)及Y型迷宫实验对大鼠颅脑创伤后Fas表达、神经细胞凋亡和认知功能障碍的相关机制进行探讨，以及应用塞来昔布药物的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 塞来昔布购自美国辉瑞制药有限公司；兔抗人Fas多克隆抗体、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteine aspartic acid protease-8，Caspase-8)多克隆抗体均购自福州迈新生物技术有限公司；PCR试剂盒、细胞和组织裂解液均购自美国Invitrogen公司；PV-6001/6002二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Y型三等臂式迷宫刺激器由华北理工大学医学实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 SPF级健康雄性Wistar大鼠96只，体质量280～300 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于华北理工大学医学实验动物中心SPF级屏障环境，Wistar大鼠，随机分为4组：对照组、假手术组、模型组、药物组，每组24只。

1.2.2 构建大鼠颅脑创伤模型 参照Marmarou et al[3]方法构建大鼠闭合型脑创伤模型，假手术组仅切开头皮缝合，不予以打击，分笼饲养，于术后2～8 h恢复饮食；对照组正常饲养，不做任何处理。

2.2 各组脑组织中Fas、Caspase-8蛋白表达 Fas、Caspase-8阳性表达定位于脑组织神经元细胞胞质或胞膜，阳性反应呈棕黄色染色，假手术组脑组织偶见阳性细胞，染色浅，模型组可见大量阳性细胞，胞质着色棕黄，染色深，药物组可见少量阳性细胞，着色程度较浅，见图1、2。经Image-Pro Plus图像分析系统半定量分析得出光密度值，见表2。各组Fas和Caspase-8表达比较差异均有统计学意义(F=112.26、84.55，P<0.001)，模型组Fas和Caspase-8表达量均高于对照组、假手术组(P<0.05)；药物组与模型组比较Fas和Caspase-8表达量均减少(P<0.05)，但仍高于假手术组和对照组(P<0.05)；假手术组与对照组之间两者的表达量比较差异无统计学意义。

该建筑总空调面积为238m2，利用DeST模拟软件进行空调负荷计算，得到全年最大的冷负荷为32.95kW，全年最大热负荷为19.03kW。由于是家用中央空调，空调同时使用系数取0.7[9]，以制冷量为23.1kW进行设备选型。空调冷热源方案拟采用加装壳管式换热器的地下水源热泵系统（方案1），为比较其节能性与经济性，与空气源热泵系统（方案2）和地埋管地源热泵系统（方案3）进行对比，方案1、2、3对应的设备选型如表1、表2和表3所示。

替格瑞洛治疗老年急性冠脉综合征患者的效果及对炎性因子、心功能的影响……………………… 郑舒 周冬翠 毕磊 等（4）446

1.2.5 实时定量荧光PCR法检测Fas、Caspase-8的mRNA表达 取出脑组织，滴加400 μl ERSR裂解液，参照TRIzol说明书提取总RNA，检测RNA纯度及浓度，逆转录反应合成cDNA，PCR扩增反应：Fas引物序列(414 bp)：上游5′-GAATGCAAGGGACTGATAGC-3′；下游5′-TGGTTCGTGTGCAAGGCTC-3′；caspase-8引物序列(109 bp)：上游：5′-CGAACGATCAAGCACAGAGAGA-3′；下游：5′-CTGGCGAGTCCCACATGTC-3′；β-actin引物序列(277 bp)：上游5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′；下游5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，72 ℃延伸7 min。实验结果采用相对定量的方法进行分析。

1.2.6 免疫组织化学法检测脑组织Fas、Caspase-8表达 常规脱蜡水化，3% H2O2室温孵育，灭活内源性过氧物酶，枸橼酸盐溶液100 ℃沸腾，组织抗原热修复；血清封闭液室温孵育；滴加兔抗人Fas(1 ∶200)、兔抗人Caspase-8多克隆抗体，于4 ℃下孵育过夜；滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃孵育；DAB显色；苏木精复染，流水冲洗反蓝；0.1%盐酸酒精分化；常规脱水透明，中性树胶封片，光学显微镜观察并采集照片；采用Image-Pro-Plus图像分析软件分析图片染色结果，依据染色分数(染色强度)评分评定结果。

1.2.8 迷宫实验检测大鼠认知功能 严格按照Y型迷宫刺激器说明要求操作，将大鼠置于迷宫中，10 s内大鼠1次成功直接逃至安全区域记为行为正确，否则记为行为错误。给予10次电刺激后有9次做出正确行为记为“学会”，记录“学会”大鼠所需训练的次数(记忆获得能力)。休息24 h后再行20次上述测试，正确行为次数记录为记忆成绩。

2.3 各组细胞凋亡情况 TUNEL染色阳性凋亡细胞为神经元细胞核内出现棕色颗粒，对照组和假手术组脑组织偶见凋亡细胞，模型组脑组织可见大量凋亡细胞，药物组可见少量凋亡细胞。对照组、假手术组、模型组、药物组的凋亡细胞数分别为(4.32±0.25)、(6.21±0.46)、(28.60±1.23)、(11.91±0.60)。各组之间凋亡细胞数差异有统计学意义(F=36.57，P<0.001)，模型组较对照组、假手术组凋亡细胞数增多(P<0.05)；药物组较模型组凋亡细胞数减少(P<0.05)，但仍高于假手术组和对照组(P<0.05)；假手术组与对照组之间两者的表达量比较差异无统计学意义。

1.2.7 TUNEL染色检测细胞凋亡情况 常规脱蜡脱水；3% H2O2室温孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶；Proteinase K工作液孵育消化15 min；标记缓冲液20 μl，保持切片湿润；封闭液50 μl，室温孵育30 min；50 μl生物素化抗地高辛抗体，37 ℃孵育30 min；50 μl链霉亲和素-生物素复合物，37 ℃孵育30 min；DAB显色；苏木精复染，脱水，透明，甘油封片，并于光学显微镜下观察拍照，计数阳性细胞数，细胞凋亡指数(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 脑组织取材 术后72 h选取SD大鼠，乙醚吸入深度麻醉，快速开胸暴露心脏，灌注生理盐水，随后灌注4%多聚甲醛，断头取脑，置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h以上。取出脑组织标本，以损伤灶为中心，切取厚约4 mm左右的组织标本，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，冠状面连续切片，厚度为4.5 μm，60 ℃烤箱烘烤4 h后，室温下保存备用。另取部分脑组织放置于冻存管中，立即投入液氮速冻，以备实时定量荧光PCR检测使用。

2.1 各组Fas、Caspase-8的mRNA表达 各组Fas和Caspase-8的mRNA表达量，见表1。各组Fas和Caspase-8表达比较差异均有统计学意义(F=25.64、36.30，P<0.001)，模型组Fas和Caspase-8的mRNA表达量均明显高于对照组、假手术组(P<0.05)；药物组与创伤组比较Fas和Caspase-8的mRNA表达量有所降低(P<0.05)，但仍高于对照组及假手术组(P<0.05)；假手术组与对照组之间两者的表达量比较差异无统计学意义。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料均采用表示，采用单因素方差分析，组间比较采用SNK法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

韩文彬发表了西方学界第一部关于中国摩崖石刻研究的著作，得益于赖非陪同他考察了峄山、泰山、洪顶山、徂徕山、葛山、尖山、水牛山等摩崖。韩文彬发现，每到一处，赖非对每一个石刻的每一个字都了如指掌。

表1 实时荧光定量PCR检测脑组织Fas、Caspase-8的mRNA表达

组别FasCaspase-8对照1.10±0.36*1.15±0.30*假手术1.16±0.44*1.20±0.37*模型2.67±0.653.36±0.62药物1.73±0.50*2.23±0.52*F值25.6446.30P值0.0000.000

与模型组比较：*P<0.05

图1 免疫组织化学染色法观察脑组织Fas表达 ×400

A：对照组；B：假手术组；C：模型组；D：药物组

图2 免疫组织化学染色法观察脑组织Caspase-8表达 ×400

A：对照组；B：假手术组；C：模型组；D：药物组

图3 TUNEL染色观察大鼠脑组织神经细胞凋亡 ×400

A：对照组；B：假手术组；C：模型组；D：药物组

1.2.3 给药方法 药物组于模型制作成功后即刻给予塞来昔布药物(250 mg/kg)腹腔内注射，随后每隔6 h给药1次，直至各时相点处死；对照组、假手术组、模型组在相同时间内给予等量生理盐水腹腔注射。

表2 免疫组织化学法检测脑组织Fas、Caspase-8的表达

组别FasCaspase-8对照10.07±1.25*8.18±1.20*假手术11.38±2.02*9.23±1.36*模型32.63±3.3224.88±2.03药物20.50±3.17*14.13±1.43*F值56.37112.85P值0.0000.000

与模型组比较：*P<0.05

“301条款”来源于美国《1974年贸易法》第301节。该节做出以下规定，当贸易对象国存在以下行为时，美国贸易代表可对他国不合理或不公平贸易做法发起调查，甚至有权终止或撤回与他国贸易协定减让的利益，或者对外国的货物或服务施加关税或其他进口限制（即各种贸易壁垒）。

2、炉后0米层接地网测量选点分别为：A、#1炉零米定排扩容器立柱处 B、#2炉送风机电动葫芦电源立柱处

2.4 各组大鼠认知功能情况 各组大鼠记忆功能比较，见表3。各组大鼠之间记忆获得次数差异无统计学意义(F=16.28，P=0.064)；各组大鼠之间记忆成绩次数差异有统计学意义(F=38.60，P<0.001)，模型组较对照组、假手术组大鼠记忆成绩次数明显减少(P<0.05)，而药物组较模型组大鼠记忆成绩次数明显增加(P<0.05)，但仍低于对照组与假手术组(P<0.05)；对照组与假手术组之间记忆成绩次数差异无统计学意义。

表3 各组大鼠记忆功能的比较

组别记忆获得记忆成绩对照32.10±3.1720.73±1.52*假手术31.48±2.6218.30±1.43*模型27.85±2.2010.25±1.18药物29.20±2.4115.50±1.30*F值16.2838.60P值0.0640.000

与模型组比较：*P<0.05

3 讨论

颅脑损伤后继发性脑损害可加重脑损伤程度，是患者颅脑损伤后致残和死亡的主要原因。大量研究[4]均证实细胞凋亡参与了颅脑损伤后继发性脑损害的病理过程，研究探索阻抑颅脑损伤后神经细胞凋亡的脑保护策略是近年研究的热点话题。环氧合酶-2是重要的炎症介质，是介导花生四烯酸代谢、血栓素A2、前列腺素生物合成过程中重要的限速酶，其介导的炎症反应、细胞毒性在继发性脑损伤神经元凋亡过程发挥重要作用[5-6]。本研究通过探讨塞来昔布对颅脑创伤后Fas表达及认知功能的影响，分析其对颅脑创伤后的保护作用及其可能机制，为塞来昔布临床应用于颅脑创伤治疗提供可靠的实验和理论依据。

目前，颅脑创伤后神经细胞凋亡已成为近几年来关注的热点，大量研究[7]均表明，颅脑损伤后神经细胞发生凋亡现象。通过调控凋亡信号转导系统阻抑神经细胞凋亡以治疗颅脑创伤正成为目前神经系统领域的研究热点之一。颅脑创伤后神经细胞凋亡的发生是一个主动的细胞死亡过程，是由抗凋亡基因和促凋亡基因参与调控的。Fas是细胞表面重要的死亡受体，属于神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体超家族成员，研究表明Fas在颅脑损伤中发挥着重要的作用，颅脑损伤后神经元凋亡发生机制中的关键性因素，Fas与Fas-L结合后，通过介导Caspase激活的外源性激活途径，再经过Caspase级联反应最终导致细胞凋亡[8-9]。Beer et al[10]研究发现在大鼠颅脑损伤灶的脑皮质内Fas、FasL高表达，并参与颅脑损伤后的凋亡及炎症反应。Rosenbaum et al[11]研究发现在大鼠局灶性颅脑损伤区神经元Fas、FasL表达增加，表明Fas介导的凋亡过程参与了颅脑损伤的病理过程。刘清军 等[12]发现在颅脑创伤后海马区神经细胞过度表达Fas mRNA，并且该区出现明显的神经细胞凋亡，推测Fas的过度表达可能是脑创伤后神经细胞凋亡的重要原因。

本研究首先参照Marmarou方法构建大鼠闭合型脑创伤模型，采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学法检测Fas、Caspase-8表达，TUNEL法检测神经细胞凋亡情况，Y型迷宫实验检测大鼠认知功能，结果发现，颅脑创伤后大鼠脑组织Fas和Caspase-8的mRNA和蛋白表达明显增高，凋亡细胞数明显增加，大鼠记忆成绩次数明显减少。而塞来昔布药物可使大鼠颅脑创伤后Fas和Caspase-8表达降低，凋亡细胞数减少，大鼠记忆成绩次数增加。考虑颅脑损伤后其可能的作用机制为Fas与其配体FasL结合，通过胞质内Fas相关死亡域蛋白，进一步和Caspase-8酶原发生相互作用，激活Caspase-8酶原，再经过Caspase级联反应最终导致神经细胞凋亡，并造成不同程度的神经功能障碍，可表现为认知功能以及智力的减退。而环氧合酶-2特异性抑制剂塞来昔布可通过抑制上述Fas介导的死亡受体途径信号通路，抑制Fas表达，进一步抑制其下游Caspase-8表达，抑制神经细胞凋亡，改善认知功能和空间学习记忆能力，发挥颅脑保护作用。王金光 等[13]研究发现Fas参与了脊髓损伤后神经细胞凋亡的调节，Fas和Caspase-3的表达变化有一定的相关性。赵景霞 等[14]研究发现颅脑创伤后海马区出现Fas蛋白表达增加并出现神经细胞凋亡，美洛宁能够减少脑创伤后Fas蛋白表达，并减少神经细胞凋亡。

参考文献

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[11] Rosenbaum D M，Gupta G，D'Amore J，et al. Fas (CD95/APO-1) plays a role in the pathophysiology of focal cerebral ischemia[J]. J Neurosci Res，2000，61(6)：686-92.

[12] 刘清军，朱 军，赵景霞，等. 大鼠脑创伤后Fas mRNA表达与细胞凋亡关系及GM-1的脑保护作用[J]. 四川大学学报(医学版)，2005，36(4)：477-9.

[13] 王金光，郑启新，赵 铭，等. 大鼠脊髓损伤后细胞凋亡及Caspase-3、Fas的表达和意义[J]. 中国康复医学杂志，2006，21(4)：296-300.

[14] 赵景霞，刘清军，崔建忠，等. 大鼠脑创伤后海马区Fas蛋白表达与神经细胞凋亡[J]. 第三军医大学学报，2005，27(12)：1226-8.