支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是新生儿常见的慢性呼吸系统疾病，其发病率随着胎龄及出生体质量的减少而增加，严重威胁到了新生儿的生命及生存质量。研究[1]显示早产儿肺发育不成熟、长期吸入高浓度氧、感染等是BPD发生的常见原因，但其发病机制仍不明确。目前，越来越多研究[2]表明遗传因素在BPD的发病中起着重要作用,同时，与高氧肺损伤相关的分子机制也有了较多的研究，但仍然不太完善。WNT信号通路是一条在进化上高度保守的信号传导通路，对胚胎动物各器官的发育起着关键作用，近年来研究[3]证实其在胚胎肺发育过程中起着必不可少的作用，贯穿了整个鼠胚胎肺发育过程。SOX9因子属于SOX转录因子家族，是细胞核内WNT信号通路的调控因子[4]，而有关于高氧暴露后肺组织SOX9表达的变化以及它与WNT信号通路在高氧暴露早产大鼠肺组织中的作用尚未见文献报道。该研究旨在通过观察SOX9因子、WNT通路关键因子β-连环蛋白(β-catenin)、淋巴增强因子(LEF-1)以及肺泡表面活性蛋白C(SPC)、α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)因子在高氧暴露后肺组织中的表达，以了解WNT信号通路是否参与BPD以及SOX9在高氧暴露后肺组织中的表达变化，探讨BPD的发病机制，为高氧致BPD的治疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 用于RT-PCR的试剂主要有TRIzol、逆转录试剂盒(北京康为世纪有限公司)，SOX9引物、β-catenin引物、GAPDH引物、LEF-1引物、SPC引物、α-SMA引物(苏州泓迅生物科技有限公司)；用于Western blot的试剂和仪器主要有RIPA组织细胞裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，SDS-PAGE凝胶试剂盒(北京索来宝科技有限公司)，PVDF膜(美国密理博公司)，兔抗鼠β-catenin单克隆一抗(美国CST公司)，兔抗鼠SOX9单克隆一抗、兔抗鼠α-SMA单克隆一抗(美国ABCAM公司)，兔抗鼠LEF-1单克隆一抗、兔抗鼠SPC单克隆一抗(北京ORIGENE公司)，鼠抗GAPDH单克隆一抗、山羊抗兔及兔抗鼠单克隆二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，ECL发光液(北京全品速生物科技有限公司)。

财税[2010]121号文第二条规定：“对出租房产，租赁双方签订的租赁合同约定有免收租金期限的，免收租金期间由产权所有人按照房产原值缴纳房产税”。

1.1.2 主要仪器 PCR仪(美国Bio-Rad公司)，JS780 SensiAnsys凝胶图像分析系统(上海培清科技有限公司)，Tanon4100全自动数码凝胶成像分析系统(上海天能公司)，ChemiDo-cXRS图像采集系统(美国Bio-Rad公司)，CYC氧浓度检测仪及空氧混合器(广东鸽子公司)。

1.2 实验动物分组和模型制备 SPF级健康SD大鼠(8～10周龄)购自桂林医学院实验动物中心，雌鼠60只(220～250 g)，雄鼠20只(250～300 g),雌雄按3 ∶1夜间合笼交配，次日晨取雌鼠阴道分泌物涂片镜检精子记为受孕第1天，将受孕21 d的大鼠剖宫后取出新生鼠即为早产鼠。早产鼠24 h内随机分为高氧组(Fio2=95%)和空气组(Fio2=21%)，每组36只，各组再随机分为3、5、9 d三个亚组，每组12只，高氧组置于60 cm×50 cm×40 cm的自制氧箱中，持续输入氧气,每天3次检测氧箱内氧浓度，维持氧浓度在95%以上，钠石灰和无水碳酸钙分别吸收CO2 和水分，每24 h定时开箱0.5 h，添加水、饲料及更换垫料，并与空气组交换母鼠以避免其因氧中毒致喂养能力下降。

1 2012年9月，拜厄特作为英国文化协会“艺述英国”活动的特邀嘉宾来华，与中国文化界代表展开对话。南京大学学者徐蕾对她进行了专访，并在《当代外国文学》上发表了题为“神话﹒历史﹒语言﹒现实：A.S.拜厄特访谈录”的文章。

1.4 RT-PCR法检测肺组织SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA mRNA表达 将肺组织取出50～100 mg置于用液氮预冷的研钵中，研磨成粉末后加入TRIzol提取总RNA，取5 μl RNA置于含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测其完整性，用紫外分光光度计检测其纯度和浓度，取肺组织总RNA 1 μg逆转录成相应的cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系包括cDNA 2 μl，上下游引物各1μl，无RNA酶水14 μl，PCR 预混合物 2 μl，共20 μl反应体系。SOX9上游引物5′-TCTACTCCACCTTCACCTACAT-3′，下游引物5′-CTGTGTGTAGACGGGTTGTT-3′(扩增产物长度为131 bp)；β-catenin上游引物5′-CAAGCCACAGGACTACAAGAA-3′，下游引物5′-CAATGTCCAGTCCGAGATCAG-3′(扩增产物长度为107 bp)；LEF-1上游引物5′-GGCGACTTAGCAGACATCAA-3′，下游引物5′-CCTGAGAGGACTGTGTTTGTC-3′(扩增产物长度为100 bp)；SPC上游引物5′-GGGTAGCAAAGAGGTACTGATG-3′，下游引物5′-ACCACAACCACGATGAGAAG-3′(扩增产物长度为117 bp)；α-SMA上游引物5′-AGGGAGTGATGGTTGGAATG-3′，下游引物5′-GGTGATGATGCCGTGTTCTA-3′(扩增产物长度为110 bp)；GAPDH 上游引物5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′，下游引物5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3′(扩增产物长度为98 bp)。反应步骤如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，58.3 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40个循环，72 ℃终末延伸5 min。反应结束后，分别取10 μl扩增产物加至含有EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，结果通过自动凝胶图像分析仪显示并拍照，分别测定条带光密度值，以GAPDH mRNA的基因表达为内参照，计算SOX9、β-catenin、LEF-1、α-SMA与GAPDH灰度值比，以此值来代表目的基因mRNA的相对表达水平。

人物性格与成长环境是他抓住的第一个联想点，第二个则是疾病与创造。这在王江民的故事上非常显眼。一个小儿麻痹患者创造出了领先世界的杀毒软件，这个人，“一生都在反对，包括反对已形成的自身。”从唯物论的角度看，自己身患残疾和后来发明杀病毒软件或许根本毫无关联，但宁肯认为疾病与人类创造力显然又有着复杂的精神关系，这是一个作家特有的文学敏感告诉他的，当然这也可能是他在访问了无数中关村的创业者之后，得出的一个结论。“非虚构”作者绝不仅仅是一个记录者，在写实、记录的上层依然有很多技巧和方法可以用来装点文本、丰富情节。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以表示，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 标本收集及处理 各组早产大鼠分别于实验3、5、9 d时用5%水合氯醛按0.006 ml/g进行腹腔注射麻醉。开胸，结扎右支气管，迅速取下右肺，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。从主支气管注入4%多聚甲醛维持15 min并置于4%多聚甲醛中过夜固定，逐级乙醇脱水，石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色，用于检测肺组织病理变化。

1.5 Western blot 法检测肺组织SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA 蛋白表达 取冻存肺组织50 mg于冰上1.5 ml EP管中，剪碎，加入500 μl的RIPA裂解液，超声3～4次，放置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取出上清液即为总蛋白,参考BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书进行蛋白浓度定量，设定浓度最低管为标准，把样品调成同一浓度，加入样品溶液，沸水浴加热15 min后置于冰上冷却，每孔加40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶室温封闭4 h后分别加入SOX9一抗、β-catenin一抗、LEF-1一抗、SPC一抗、α-SMA一抗(均按1 ∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min,加入HRP标记的二抗(1 ∶5 000稀释)室温摇动孵育1 h，TBST洗涤3次，用ECL化学试剂发光，曝光1 min，用ChemiDo-cXRS图像采集系统采集图像。以GAPDH(1 ∶1 000)作为内参照，Image J软件检测条带灰度值，计算SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA与内参GAPDH的灰度值比值，该比值代表目的蛋白的相对表达水平。

本次研究中对卵巢囊性病变患者实施MR检查。数据统计显示，患者中卵巢囊肿41例，卵巢子宫内膜异位囊肿17例，卵巢囊腺瘤14例，卵巢畸胎瘤12例，囊性卵巢癌6例，MR术前检查诊断正确率为88.9%;良性诊断符合率为100.0%，良恶性鉴别准确率为97.8%。上述结果表明，MR检查影像清晰，能较为准确的判断卵巢囊性病变类型，值得在临床应用中推广使用。

2 结果

2.2 肺组织SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA 的mRNA表达 高氧组早产大鼠肺组织β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA在3、5、9 d的mRNA表达均高于空气组(F=7.705、14.549、9.444、7.974,P<0.05),并且高氧组mRNA相对表达量随氧暴露时间的增加而增加，SOX9在高氧3、5、9 d mRNA相对表达量呈递减趋势，但仍高于空气组，在3 d和5 d 时，SOX9 mRNA表达与空气组相比差异有统计学意义(P<0.01),在9 d时，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.1 肺组织病理学改变 空气3 d组、5 d组、9 d组在低倍镜(×100)下观察，可见肺组织结构基本正常，肺泡丰富，大小均一，并且随着出生天数的增加肺泡数量增多。高氧3 d组肺组织见明显渗出、大量炎症细胞浸润、出血性改变及肺泡压缩，高氧5 d组可见肺组织结构紊乱，肺间质增宽，9 d组可见肺泡炎症细胞明显减少，肺间隔明显增宽，小肺泡减少，肺泡腔增大，肺组织结构紊乱且肺泡结构简单，见图1。

在WNT/β-catenin途径中，当细胞外WNT信号分子蛋白与Fz和低密度脂蛋白相关蛋白 5/6结合使胞内蓬乱蛋白发生磷酸化而激活，活化的蓬乱蛋白抑制糖原合成酶3β活性，使β-catenin无法磷酸化，从而避免被泛素-蛋白酶体系降解，β-catenin在胞内富集并进入胞核与 T淋巴细胞因子/淋巴样增强因子 (TCF/LEF)结合，启动靶基因转录，因此Wnt/β-catenin通路信号活化必然会使β-catenin的表达增加[7]。LEF-1和β-catenin作为经典WNT信号通路中的关键转录因子，在高氧3、5、9 d组的mRNA和蛋白表达量均高于空气3、5、9 d组，表明经典WNT信号通路在高氧致BPD模型中是处于激活状态，提示WNT信号通路参与了高氧肺损伤。

3 讨论

图1 空气组和高氧组早产鼠在各时间点的肺组织病理改变 HE×100

图2 空气组和高氧组在各时间点SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA mRNA的相对表达

M：marker；A：空气3 d组;B：空气5 d组；C：空气9 d组；D：高氧3 d组；E：高氧5 d组；F：高氧9 d组；与同时间点空气组比较：*P<0.05，**P<0.01

图3 空气组和高氧组在各时间点SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA蛋白的相对表达

A：空气3 d组;B：空气5 d组；C：空气9 d组；D：高氧3 d组；E：高氧5 d组；F：高氧9 d组；与同时间点空气组比较：*P <0.05，**P<0.01

WNT信号通路是一类控制细胞生长、增殖、传递细胞间相互调控信息的信号通路，它主要由经典WNT信号途径和非经典WNT信号途径组成。经典WNT信号通路即WNT/β-catenin信号通路，是目前研究最为广泛的，也是与肺发育密切相关的信号通路，它不仅在肺的早期发育阶段调节细胞的增殖和分化，对后期肺结构的维持也是起着重要作用,近年来人们也逐渐认识到它在肺部疾病的发生发展过程中起的重要作用[5]，包括特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、BPD等。目前，已有较多关于经典WNT信号通路与特发性肺纤维化之间关系的研究 [6]，而研究WNT信号通路在高氧肺损伤中的作用才刚刚开始。

2.3 肺组织SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA 的蛋白表达 高氧组早产大鼠肺组织β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA的蛋白表达均高于对应时间点的空气组(F=18.747、87.959、9.281、13.886,P<0.05)，SOX9在高氧3 d、5 d的蛋白表达高于对应时间点的空气组，差异有统计学意义(P<0.01),在9 d时，高氧组与空气组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

为研究沿海钢管板桩码头受力特性，本文以福建泉州某钢管桩码头为实例对象，通过建立二维、三维数学模型，对码头受力特性进行详细分析，并对比两种计算方法的精度。

本研究中空气各组肺组织结构基本正常，高氧3 d组肺组织见明显渗出、大量炎症细胞浸润、出血性改变及肺泡压缩，高氧5 d组和9 d组可见肺间隔增宽及肺泡结构紊乱，表明成功建立了高氧肺损伤模型。经检测发现，高氧组肺组织SPC、α-SMA和蛋白表达均高于空气组，且随着高氧暴露天数的增加表达量也增加，而空气各组SPC和α-SMA表达量未见明显差异。由于SPC是由Ⅱ型肺泡上皮细胞产生的特异性表面活性蛋白[8]，对肺泡结构的完整起着重要作用，因此它在高氧组表达增高提示在高氧情况下Ⅱ型肺泡上皮细胞不断的增殖,但是向Ⅰ型肺泡上皮细胞分化受阻,导致肺泡的修复受损,代之以纤维细胞的增生来修复, α-SMA是间叶细胞的标志,表达在肌成纤维细胞中[9],因此，高氧组α-SMA表达高于空气组，且α-SMA在高氧3、5、9 d的表达呈逐渐增高的趋势，提示随着高氧暴露时间的增加，肺组织纤维化越来越重，这与病理切片结果相一致。

SOX(SRY_related HMG_box)基因家族是一类编码转录因子的基因,参与多种组织早期胚胎发育过程，对多种组织器官的发育具有重要作用[10]，SOX9是SOXE亚族的一个成员，有研究[11]显示它表达在呼吸道外周上皮祖细胞中，对肺分支形态的形成起着重要作用，也有研究认为它在呼吸道上皮细胞的表达没有意义[12]。而有关SOX9与WNT信号通路的关联在不同的实验研究中有着不同的结论，在肺腺癌中发现SOX9表达增加与WNT/β-catenin信号通路激活有关[13]；在肠的发育过程中，SOX9被认为是WNT信号通路的直接调控因子[14]；在肺的发育过程中，Rockich et al[11]认为WNT/β-catenin并不调节SOX9的表达；Ustiyan et al[15]在实验中发现WNT/β-catenin在呼吸道上皮祖细胞中既可促进SOX9的表达，又可抑制SOX9的表达，可见SOX9与WNT信号通路的相互作用非常复杂，而有关SOX9基因功能改变与早产BPD的关系,目前国内外尚未开展这方面的研究。

本研究显示高氧组SOX9的核酸和蛋白表达量均高于空气组，以高氧3 d和高氧5 d最为明显，而高氧3 d组的表达量又高于高氧5 d组，因此推测在高氧致急性肺损伤时，SOX9表达增加可能是应激性增加，是为了抑制WNT信号通路的激活来保护肺不受损害，但是随着高氧暴露时间的增加，SOX9的表达逐渐降低，也许与SOX9无法抑制WNT/β-catenin信号通路的激活反而被WNT/β-catenin信号通路抑制有关。

综上所述，本研究显示高氧暴露通过激活WNT信号通路致早产大鼠肺组织损伤，同时WNT信号通路的激活可能是通过抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞向Ⅰ型肺泡上皮细胞分化，因此肺泡上皮不能正常修复，从而导致肺组织最后纤维化，而SOX9则可能是通过抑制WNT信号通路来参与高氧肺损伤。而有关SOX9及WNT/β-catenin信号通路在高氧肺损伤中的具体机制仍有待进一步研究。

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