肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化发生过程中起重要作用，其增殖与活化是肝纤维化发生的重要诱因，活化的HSC分泌大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，交联形成纤维束，导致肝纤维化的发生[1]。酒精代谢会产生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，ROS作为一个关键的第二信使参与人体内许多信号通路，包括转录调控、分化和增殖等[2]。研究[3-4]表明ROS可通过MAPK信号通路、TGF-β信号通路以及PI3K-Akt等多条细胞信号通路导致HSC活化和增殖。酒精可以诱导烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)的高表达来加快自身的代谢，代谢过程消耗O2产生大量的ROS [5]。NOX至少有七种亚型，肝脏中主要表达NOX1，不表达或少表达NOX4，均需与NADPH氧化酶亚基p22phox(p22phox)结合成免疫复合物才能发挥作用。长期酗酒，酒精会诱导NOX4的高表达，生成大量ROS，是导致肝细胞凋亡和坏死，肝星状细胞激活的重要原因[6]。从乙醇灌胃诱导酒精性肝病的大鼠模型中分离出来的HSCs细胞中发现I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)表达的增加[7]。用乙醇诱导人或鼠的HSC细胞也会刺激α-SMA高表达[8]。

蝉翼藤为广西民族特色中草药，有较强的抗菌消炎、抗癌、增强免疫等疗效[9]。甲基阿魏酸(methyl ferulic acid,MFA)是从蝉翼藤中提取的一种有机酸，本课题组前期研究[10]显示MFA可抑制TGF-β1诱导的HSC细胞活化和增殖。该实验以人肝星状细胞(human hepatic stellate cells-LX2,HSC-LX2)为研究对象，研究MFA对乙醇诱导的HSC-LX2细胞干预作用，通过检测HSC-LX2中NOX4、p22phox以及α-SMA的表达情况，ROS的含量变化情况来探讨甲基阿魏酸抗肝纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人源性肝星状细胞株HSC-LX2购自博慧斯(无锡)生物医药科技有限公司。

1.1.2 主要仪器及试剂 MFA(批号：101236152)、MTT(批号：M2128)、DCFH-DA购自美国Sigma公司；CO2培养箱(型号：311)、高糖DMEM培养基、Hyclone胎牛血清购自美国Thermo公司；酶标仪(型号：ELX-800)购自美国BIO-RAD公司；RNA pure高纯总RNA提取试剂盒、TIANS cript cDNA第一链合成试剂盒(北京TIANGEN公司)；乙醇、兔抗GAPDH单克隆抗体、鼠抗α-SMA单克隆抗体、兔抗NOX4单克隆抗体、兔抗p22phox单克隆抗体(上海生工公司)；普通ECL Plus发光液(北京泛博生化公司)；青霉素、链霉素(南通碧云天生物技术研究所)。α-SMA、p22phox、NOX4、β-actin引物(上海生工公司)，见表1。

2.1 不同浓度乙醇对HSC-LX2细胞的诱导作用 不同浓度乙醇诱导HSC-LX2细胞48 h后，测得OD值，经计算得到细胞增殖率。结果表明，在作用48 h下，乙醇浓度在50 mmol/L 范围内随着时间增加细胞增殖率增加，乙醇浓度大于50 mmol/L 时细胞增殖率明显下降，见图1。

表1 引物序列

基因引物序列(5'-3')α-SMA F:GTCCCAGACATCAGGGAGTAAR:TCGGATACTTCAGCGTCAGGAp22phox F:TATTCTTGCAGGAGTGCTCATCR:GTCACACGACCTCATCTGTCACNOX4 F:GAAGGGGTTAAACACCTCTGCR:ATGCTCTGCTTAAACACAATCCTβ-actin F:TGTTACCAACTGGGACGACAR:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

1.2.1 细胞培养和传代 HSC-LX2用成分为10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM培养液培养，并置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，隔天换液。当显微镜下观察细胞形态为单层的紧密状态时，用EDTA-胰蛋白酶消化传代。

1.2 检测指标和方法

2.2 乙醇对HSC-LX2细胞中相关蛋白表达的影响 HSC-LX2细胞经乙醇诱导48 h后，在各时间点提蛋白，Western blot检测结果见图2，在48 h内乙醇刺激HSC-LX2中α-SMA、p22phox和NOX4蛋白的高表达，且在24 h时作用更明显，与0 h相比，差异有统计学意义(Fα-SMA=29.431、Fp22phox=57.172，FNOX4=39.034，P<0.05，P<0.01)。

1.2.7 RT-PCR法检测HSC-LX2细胞相关 mRNA表达 将HSC-LX2细胞以3×106接种于直径为10 cm的培养皿中，细胞分为正常对照组、模型组、MFA低剂量组、MFA中剂量组和MFA高剂量组。正常对照组仅含10%胎牛血清培养液，模型组含50 mmol/L乙醇，MFA低剂量组给予50 mmol/L乙醇+25 μmol/L MFA，MFA中剂量组给予50 mmol/L乙醇+50 μmol/L MFA，MFA高剂量组给予50 mmol/L乙醇+100 μmol/L MFA。细胞贴壁生长量好后，更换上述培养基培养24 h，收集细胞，按总RNA提取试剂盒的说明书，用TRIzol法提取HSC-LX2中总RNA。用核酸蛋白测定仪测定RNA含量和纯度。取5 μg RNA，用RNA逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。然后再进行PCR扩增，PCR反应总体积为20 μl，热循环条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环后于72 ℃延伸5 min。反应结束后分别取10 μl扩增产物和DNA Marker上样，进行琼脂糖凝胶电泳，DNA带进行观察和紫外线灯拍摄。Bio-Rad自动凝胶成像分析系统检测OD值，Quantity One软件进行分析，以β-actin为参照物。

1.2.4 MTT法检测MFA对HSC-LX2细胞的药物毒性 取对数生长期的HSC-LX2细胞接种于96孔板，1×104/孔，放入培养箱中培养到细胞贴壁时，将细胞分为7组，并设置复孔，弃去原培养基，每孔分别加含有不同浓度MFA的含血清培养基200 μl(MFA浓度分别为100、200、300、400、500、600、700 mmol/L)，分别培养1、2、3 d，用MTT法检测细胞抑制率，并作图分析。

常规双心钻头普遍存在扩孔钻进效率低、扩孔能力差、扩孔后井径不规则、扭矩波动幅度大、横向不平衡力幅值大等问题，难以适应深井定向随钻扩孔钻进[3-5]。其中，常规双心钻头的总体横向不平衡力常常超过钻头轴向力的20%[2,6-7]，在钻井过程中会导致钻头领眼段切削齿磨损严重不均匀，而个别切削齿的提前失效会影响钻头的径向布齿，降低钻头的切削效率，致使钻头领眼段切削齿的寿命提前终结。因此，需增强钻头的稳定性以提高钻头的钻进效率。本文将对定向随钻扩孔PDC钻头结构优化设计展开相关研究，以提高其稳定性。

采用HPLC-ELSD方法，测定了多批样品中的硫酸盐含量，进而确定了分子式中硫酸的数目，结合样品的酸碱度值，建立了样品酸碱度与硫酸盐含量的关系，对于现行质量标准中的酸碱度是否可以有效控制产品质量开展分析。

1.2.5 MTT法检测MFA对乙醇诱导HSC-LX2细胞的抑制作用 取对数生长期的HSC-LX2细胞接种于96孔板，1×104/孔，放入培养箱培养24 h后将细胞分为正常对照组、乙醇对照组和给药组。给药组分别加12.5、25、50、100、200、400 mmol/L的MFA，继续培养24 h后，乙醇对照组和给药组分别加50 mmol/L乙醇，培养20 h后，避光加MTT 20 μl，继续培养4 h，弃去培养基，加二甲基亚砜(DMSO)150 μl，在室温下放于摇床，低速振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长下测得吸光度(optical density,OD)值，重复3次取平均值。利用公式计算细胞抑制率并作图分析不同浓度MFA对HSC-LX2细胞增殖的抑制作用。抑制率计算公式为细胞抑制率(%)= (对照组OD值-实验组OD值) /对照组OD值×100%。

1.2.6 MFA对乙醇诱导的LX-2细胞中ROS生成的影响 取对数生长期的HSC-LX2细胞接种于96孔板，1×104/孔，放入培养箱培养24 h后将细胞分为正常对照组、模型组和给药组。给药组分别加25、50和100 mmol/L的MFA，继续培养24 h后，模型组和给药组分别加50 mmol/L乙醇培养24 h后，加入DCFH-DA探针孵育30 min，将96孔板立即置于多功能酶标仪中检测各孔荧光强度，激发波长和发射波长分别设定为485 nm和528 nm。

1.2.3 Western blot法检测乙醇对HSC-LX2细胞最佳诱导时间 将HSC-LX2细胞以3×106接种于直径为10 cm的培养皿中，将培养皿放入培养箱中培养至细胞生长状态良好后，细胞分为正常对照组以及乙醇组。正常对照组细胞用不含乙醇的血清培养基培养。乙醇组用含50 mmol/L乙醇的血清培养基培养。0 h时，提取正常对照组的蛋白，BCA法测定蛋白含量，用Western blot法测定HSC-LX2细胞中GAPDH、α-SMA、p22phox以及NOX4蛋白表达。乙醇组细胞在分别培养1、3、6、12、24、48 h后，相同方法测GAPDH、α-SMA、p22phox以及NOX4蛋白表达。用Bio-Rad自动凝胶成像分析系统定量分析印迹。

1.2.8 Western blot法检测HSC-LX2细胞相关蛋白表达 细胞分组同1.2.7，培养24 h后弃去培养皿中的上清液，冰上用生理盐水清洗培养皿3次，加入RIPA裂解缓冲液裂解细胞，于冰上放置10 min使其充分裂解，收集细胞裂解物。在4 ℃离心机以12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定上清液中蛋白含量。取含100 μg总蛋白的上清液，加入5×buffer煮沸5 min后进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后把蛋白转移到硝酸纤维膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，封闭结束后，用TBST溶液洗膜5 min，然后加入一抗[α-SMA一抗(1 ∶500)、NOX4一抗(1 ∶400)、p22phox一抗(1 ∶1 000)以及GAPDH一抗(1 ∶1 000)]孵育，4 ℃过夜。第二天用TBST洗膜4次，每次8 min，再与辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶8 000)作用1 h，TBST洗膜4次，每次8 min。在暗室用ECL发光液发光显色。用Bio-Rad自动凝胶成像分析系统定量分析印迹。GAPDH蛋白用作内部对照。

由θ的先验分布可知显然关于{Wt，t≥0}是鞅，关于{Bt，t≥0}。且在T有界时，依据等距[14]可知是平方可积鞅，有同理，是平方可积鞅，且由文献[15]及大数定律可得

室管膜瘤：2例为间变性室管膜瘤，1例为室管膜瘤。本组3例肿瘤均呈边界清晰、形态不规则的囊实性肿块，T1WI呈等低信号，T2WI呈高低信号，增强后实性部分及囊壁明显不均匀强化，囊内未见强化，病灶周围水肿不明显（图3）。所有病例均出现梗阻性脑积水，1例形成小脑扁桃体疝。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行分析，数据以表示。采用单因素方差分析(ANOVA)确定各组之间的显著性差异。各组之间比较采用SLSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

（7）无基布滤料的研发方向：生产设备及工艺进一步调整，可通过添加杂乱辊，配套梳理机合适的针布种类、针角、针密、针刺机的植针密度、刺针选型等措施优化无基布滤料的性能；探究纤维规格与滤料成品各项性能指标的关系，获得最合适的纤维规格选型；开发其他种类无基布滤料，包括纯纤维无基布滤料、复合纤维无基布滤料，从而可以获得更多的应用市场。

因为规模的问题，集散中心的组织协助也是一个重要的因素。由一个单一小农户的生产量来证明其对超市卖场的个别装配和运输是不够的。在当地集散中心，一些农民的农产品被收集、分类、包装和运输到超市卖场。集散中心需要足够规模以进行有效的运作，可个体小农户却并不能达到此要求。在这项研究中，APROFHI和DIVEFRU这两个组织是连接洪都拉斯小农户与新鲜果蔬超市供应链的纽带[6]1-65。

图1 不同浓度乙醇对HSC-LX2细胞的诱导作用

1.2.2 MTT法检测乙醇对HSC-LX2细胞的诱导作用 取对数生长期的HSC-LX2细胞接种于96孔板，1×104/孔，用含5～95 mmol/L乙醇的血清培养基分别培养0、1、3、6、12、24、48 h，MTT法检测细胞存活率，并作图分析。

2.3 不同浓度MFA对HSC-LX2细胞的毒性作用 不同浓度MFA对HSC-LX2细胞作用3 d后，测得OD值，经计算得到细胞抑制率，结果见图3，MFA浓度在100～400 μmol/L内，随着作用时间增加细胞抑制率变化幅度不大，说明这一范围内MFA毒性作用小，所以选取MFA浓度在400 μmol/L之内进行以下实验。

2.4 不同浓度MFA对乙醇诱导HSC-LX2细胞增殖的抑制作用 不同浓度的MFA对乙醇诱导HSC-LX2细胞干预后，测得OD值，经计算得到细胞抑制率，结果表明，MFA浓度在100 mmol/L以内，随着浓度的增加，抑制率增加；而浓度大于100 mmol/L时抑制率反而下降，因此选择25、50和100 mmol/L作为药物MFA低、中和高浓度进行后续实验(F=24.902，P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 不同浓度MFA对乙醇诱导HSC-LX2的抑制率比较

组别浓度(mmol/L)OD490值抑制率(%)正常对照-0.56±0.060-乙醇对照-0.79±0.048-MFA12.50.68±0.027*13.92250.62±0.023*21.52500.56±0.040**29.111000.50±0.035**36.712000.57±0.025**27.854000.63±0.052*20.25

与乙醇对照组比较：*P<0.05,**P<0.01

2.5 MFA对HSC-LX2细胞中ROS生成的影响 不同浓度的MFA对乙醇诱导HSC-LX2细胞干预后，加入DCFH-DA探针孵育30 min，测各孔荧光强度，结果显示乙醇刺激HSC-LX2中ROS含量显著增加，MFA能减弱ROS生成，与模型组相比差异有统计学意义，且高剂量作用效果更明显，差异有统计学意义(F=43.853，P<0.05，P<0.01)。见图4。

2.6 MFA对HSC-LX2细胞中相关mRNA表达的影响 MFA和乙醇作用于HSC-LX2细胞24 h后，收集细胞，提取RNA，RT-PCR结果显示乙醇刺激HSC-LX2中α-SMA、NOX4和p22phox mRNA高表达，MFA干预后降低细胞中α-SMA、NOX4和p22phox mRNA表达，高剂量作用效果更显著，差异有统计学意义(Fα-SMA=137.428，Fp22phox=59.417，FNOX4=63.538，P<0.05)。见图5。

图2 乙醇作用于HSC-LX2 48 h内α-SMA、p22phox、NOX4和GAPDH蛋白表达

A：Western blot图；B：α-SMA；C：NOX4；D：p22phox；与0 h比较：*P<0.05，**P<0.01

图3 不同浓度MFA对HSX-LX2细胞的毒性作用

2.7 MFA对HSC-LX2细胞中蛋白表达的影响 经MFA和乙醇诱导HSC-LX2细胞24 h后，Western blot法检测α-SMA、NOX4和p22phox蛋白表达，结果显示，模型组中α-SMA蛋白表达量与正常对照组比较显著增加，同时模型组中NOX4和p22phox表达与正常对照组相比，蛋白表达量均明显增加。药物干预后α-SMA、NOX4和p22phox蛋白表达量均显著下降，高剂量组抑制作用更明显，差异有统计学意义(Fα-SMA=62.530，FNOX4 =45.937，Fp22phox=34.714，P<0.05)。见图6。

3 讨论

酒精性肝纤维化是严重危害公共卫生的最常见疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势[11]。虽然近年来关于酒精性肝纤维化的研究已经取得很大进展，但尚未有令人满意的治疗方法。本课题从HSC-LX2的增殖和活化这一角度出发，研究甲基阿魏酸抑制肝纤维化的作用机制。

HSC是肝脏分泌ECM的主要细胞，在肝纤维化的发展机制中占有重要的地位，备受人们关注[12]。活化的HSC伴随着维生素A的储存损失和细胞骨架蛋白的上调表达如α-SMA和结合蛋白[13]。因此α-SMA被认为是HSC活化的重要标志之一。NOX4可诱导ROS过表达进而激活HSC，而过量乙醇会导致NOX4的高表达，即乙醇可通过诱导NOX4过表达进而诱导ROS高表达、激活HSC。本实验通过MTT法和Western blot法测得乙醇诱导HSC-LX2细胞的最佳浓度和作用时间点。乙醇浓度在5～50 mmol/L范围内，随着时间推移，乙醇诱导HSC-LX2增殖，细胞存活率逐渐增加，当乙醇浓度大于50 mmol/L时，HSC-LX2细胞存活率反而随着时间的增加而降低。经乙醇诱导HSC-LX2细胞后，α-SMA、p22phox和NOX4蛋白表达水平在24 h内随着作用时间增加而逐渐增加，24 h达到最大表达量,反而乙醇作用48 h时，相关蛋白表达含量均低于24 h的表达量，呈下降趋势。说明乙醇诱导HSC-LX2细胞24 h时，对HSC-LX2作用最强。因此，选取浓度为50 mmol/L乙醇诱导HSC-LX2细胞24 h作为模型展开实验。

图4 MFA对乙醇诱导HSC-LX2细胞中ROS生成的影响

A：正常对照组；B：模型组；C：MFA高剂量组；D：MFA中剂量组；E：MFA低剂量组；与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01

图5 MFA作用下各组HSC-LX2的α-SMA、NOX4和p22phox mRNA表达

A：PCR图；B：α-SMA；C：NOX4；D：p22phox；1：正常组；2：模型组；3：MFA高剂量组；4：MFA中剂量组；5：MFA低剂量组；与正常对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01

图6 MFA作用下各组HSC-LX2细胞中相关蛋白表达

A：Western blot图；B：α-SMA；C：NOX4；D：p22phox；1：正常组；2：模型组；3：MFA高剂量组；4：MFA中剂量组；5：MFA低剂量组；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01

MFA是从蝉翼藤中提取的一种化合物，课题组前期研究[14]显示MFA通过抑制大鼠HSC的增殖而减少ECM的合成，从而抑制大鼠肝纤维化。本实验通过MTT法来检测不同浓度MFA对HSC-LX2的毒性作用。MFA浓度为100～400 μmol/L时，细胞的存活率在90%以上，上下波动幅度不大，表明 当MFA浓度低于400 μmol/L时对HSC-LX2细胞无毒性作用。在400 μmol/L以内选取7个浓度梯度干预酒精诱导HSC-LX2，当MFA浓度小于100 μmol/L时，HSC-LX2生长的抑制率呈剂量依赖式增加；当药物浓度大于100 μmol/L时，细胞生长的抑制率反而不断下降。MFA浓度为100 μmol/L时，抑制作用达到最大化(P<0.01)。因此，选取25、50、100 μmol/L分别作为MFA低、中、高剂量组的浓度。

在MFA干预经乙醇诱导HSC-LX2细胞后，经过荧光酶标仪检测细胞中ROS表达，模型组与正常对照组相比，荧光密度显著增加，说明乙醇可诱导ROS高表达，进而活化HSC-LX2。MFA干预后，药物组HSC-LX2中的荧光密度与模型组相比，均显著减弱，说明MFA可抑制ROS的表达，从而抑制HSC活化。RT-PCR法和Western blot法分别检测HSC-LX2细胞中NOX4、p22phox和α-SMA的mRNA和蛋白表达。结果显示：与正常对照组相比，模型组中α-SMA的mRNA及蛋白表达均显著增加，说明乙醇可诱导HSC-LX2细胞活化。给药组的NOX4和p22phox的mRNA及蛋白表达较模型组相比均显著下降，且呈剂量依赖式下降。表明MFA可通过抑制NOX4和p22phox来减弱HSC-LX2活化及增殖。

在长径比不变（λ=8）的条件下，泊松比从0.1到0.5；摩擦系数从0.1到0.5；计算得到相对压强随泊松比和摩擦系数的变化曲面如图5所示。

综上所述，MFA可通过抑制α-SMA的表达进而抑制HSC-LX2活化和增殖， MFA也通过减弱乙醇诱导的NOX4和p22phox高表达，进而减弱HSC-LX2细胞中ROS生成达到抑制HSC-LX2活化的效果。由于HSC-LX2的活化可直接导致肝纤维化的发生，我们推测MFA有抑制肝纤维化发展的作用，但其是否通过直接抑制NOX4、p22phox和α-SMA来发挥抗肝纤维化作用，还有待进一步研究。

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