随着人工流产及宫腔镜手术的发展，子宫内膜损伤日益常见。预防宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)及宫腔粘连分离术(transcervical resection of adhesions，TCRA)后再粘连成棘手且亟待解决的问题。虽然术后应用雌激素促进子宫内膜修复被广泛应用，但其最佳用量尚无定论，有报道[1]称雌激素过低或过高均不利于子宫内膜修复。有研究[2]表明新鲜羊膜移植入TCRA术后的宫腔，能有效降低宫腔再粘连的发生率，宫腔粘连诊治指南也将其作为IB级推荐[3]，羊膜移植有望成为治疗宫腔粘连的新途径。该实验通过原代培养子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells，ESCs)，探讨羊膜支架上促进子宫内膜基质细胞增殖的雌二醇的适宜浓度，以期为雌激素用量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM-F12培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司)；Ⅱ型胶原酶(美国Invitrogen公司)；兔抗人细胞波形蛋白抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；荧光定量及逆转录试剂盒(日本TOYOBO生物科技有限公司)；17-β雌二醇(美国Sigma公司)；增殖细胞抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) mRNA引物由上海生工公司设计合成。

设计师可以使用各种设计手法、自然采光等来实现自然通风，在建筑原有空间的基础上进行空间改造最大限度的减少设计方案造成的通风不足和自然光的减少。使其尽可能保持其原有的优势。同时，太阳能和风能是取之不尽，用之不竭的可再生能源，而且无污染在很大程度上将对室内设计产生一定的影响。因此，在室内设计中，我们应该尝试在设计中加入这些元素，以减少能耗。

1.2 细胞培养与鉴定 经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准，在患者知情同意的前提下，取2016年5月～9月因不明原因不孕行诊刮术患者子宫内膜组织少许，均经病理检查证实均为正常增生期内膜。患者年龄22～39(31.02±0.23)岁，术前3个月内均未服用过激素类药物。参照 Arnold et al[4]方法并加以改良:无菌条件取子宫内膜组织剪至糊状，以0.25% Ⅱ型胶原酶消化40 min后，依次经200目、400目细胞筛网分离出子宫内膜基质细胞，以 1×106/ml密度接种，用含10%FBS的DMEM-F12培养基于含37 ℃、5% CO2培养箱(美国Thermo公司)中进行培养，融合度达80%～90%时传代。采用免疫细胞化学法以波形蛋白抗体为一抗、PBS代替一抗作为阴性对照鉴定第3代子宫内膜基质细胞，以显微镜下细胞质染成棕黄色为阳性，细胞质未着色为阴性。

1.3 新鲜羊膜的制备 参照Lee et al[5]的方法，无菌条件下钝性分离法取正常足月剖宫产羊膜。用胰酶消化后羊膜上皮面朝上，用自制刮刀轻柔刮除羊膜上皮细胞，显微镜显示刮除干净后将羊膜剪成6孔板大小。羊膜基质面朝上铺于6 孔板中，于培养箱中干燥数分钟待用。

1.5 CCK-8法测细胞增殖率 48孔板接种细胞2×105个/孔，采用CCK-8法测普通培养基及羊膜支架上细胞OD值并绘制生长曲线。计算不同浓度雌二醇处理后各组细胞的增殖率。细胞增殖率(%) = (OD实验组/OD对照组) ×100% 。

1.6 RT-PCR法测PCNA mRNA的相对表达量 以1×106/ml密度将细胞接种于6孔板中，提取各组细胞总RNA。目的基因引物序列F:5′-TCTGAGGGCGTTCGACACCTA-3′，R:5′-CGCGTTATCTTCGGCCCTTA-3′，内参引物序列F:5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，R:5′-CTGGAAGGTGGACAG-CGAGG-3′。所用引物均由上海生工有限公司合成，参照逆转录及荧光定量试剂盒说明，PCR循环参数为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40个循环。2-ΔΔCt法计算在各组细胞中PCNA mRNA的相对表达量。

1.4 细胞接种与雌二醇处理 将生长良好的第3代细胞接种于羊膜基质面的作为实验组，接种于普通培养基对照组。更换无血清培养基培养 24 h后。参照白晓霞 等[6]研究，按加入雌激素浓度进行分组，未加入雌二醇组为A组，余各组分别加入不同浓度的17-β 雌二醇(mol/L)：1×10-8(B组)、1×10-7(C组)、1×10-6(D组)、1×10-5(E组)，将细胞置于 37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养24 h、48 h、72 h。

1）树立资源为先的战略，千方百计打造稳定的低硫燃油资源供应渠道。低硫燃油资源的稳定供应直接关系到船舶在港口的合规运营，随着国际海事组织2020低硫政策临近，船供油公司传统的高硫燃油资源渠道将发生根本性变化，多年合作的供应商目录将出现很大变动。船供油公司不仅需要寻找新的低硫燃油供应商，还需要在信用政策、操作流程、风险管理以及商业模式等方面进行全面调整，务必要在1年内重新打造并优化供应渠道，时间非常紧张，任务非常艰巨。

2.2 细胞增殖率 设α=0.10为检验水准，球形检验的P>0.01(对照组P=0.837，实验组P=0.123)，故没有足够的证据可以否认该资料符合重复资料的方差分析条件。细胞分别培养24、48、72 h后，同一时间点A、B、C、D、E组5组间细胞增殖率两两比较结果提示：A组增殖率低于B、C、D、E组，D组增殖率高于A、B、C、E组，差异均有统计学意义(P<0.05)，B、C、E组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明各浓度雌二醇均促进细胞增殖，且以10-6 mol/L组增殖最明显，而不与浓度成正比；方差分析结果表明：同一雌激素浓度，随着雌二醇作用时间的延长，细胞增殖率明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)，且两相邻时间点差异有统计学意义(P<0.05)，见表1；相同浓度实验组与对照组增殖率比较均有统计学意义(P<0.05)，见图2、3。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，实验数据以表示，采用重复测量方差分析比较实验组及对照组的差异，各组间资料的分析采用One-Way ANOVA法，采用LSD-t法进行两两比较。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.3 PCNA mRNA的相对表达量 设α=0.10为检验水准，球形检验的P>0.01(对照组P=0.171，实验组P=0.314)，故没有足够的证据可以否认该资料符合重复资料的方差分析条件。细胞分别培养24、48、72 h后，同一时间点A、B、C、D、E组5组间细胞PCNA mRNA表达两两比较结果提示：A组低于B、C、D、E组，D组高于A、B、C、E组，差异均有统计学意义(P<0.05)，B、C、E组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明各浓度雌激素均促进细胞PCNA mRNA表达，且以10-6 mo/L组PCNA mRNA表达最高，而不与浓度成正比，见表2；同一雌二醇浓度，随着雌二醇作用时间的延长，PCNA mRNA表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)，且两相邻时间点差异有统计学意义(P<0.05)；相同浓度实验组与对照组PCNA mRNA表达的比较均有统计学意义(P<0.05)，见图4。结果与CCK-8细胞增殖率结果一致。

人们认为创造性的产品有两个衡量标准:(1)新颖性，(2)适用性。新颖性意味着不是已有存在物的重复，不是原有东西的再现，一定包含原来没有或未发现的东西。适用性是指这个产品对人的生活、对社会具有价值。从“产品”的视角，创造力被定义为:产生新颖且有价值的产品的能力。创造力是运用已有资源来创造某种新颖、独特、有社会或个人价值的产品的能力。创造性产品的内容，可以是新概念、设想、理论，新工艺、技术、设计，也可以是其他物质产品或社会服务，总之要有新的产品或服务提供给社会。

图1 子宫内膜基质细胞培养与鉴定

A：普通培养基上细胞接种后12 h(×40)；B：普通培养基上细胞接种后48 h(×40)；C：羊膜支架上细胞接种后12 h(×40)；D：羊膜支架上细胞接种后48 h(×40)；E：免疫细胞化学染色结果(SP×400)：波形蛋白染色阳性，胞质呈棕黄色；F：免疫细胞化学染色结果(SP×400)：PBS阴性对照，胞质未着色，胞核呈蓝紫色

表1 不同浓度雌二醇作用对照组及羊膜组子宫内膜基质细胞增殖率

组别对照组24h48h72h实验组24h48h72hA1.000±0.1111.805±0.4533.503±0.3281.416±0.1182.200±0.2174.592±0.350B1.218±0.0262.404±0.0263.189±0.1322.686±0.1042.838±0.1085.285±0.176C1.253±0.8622.470±0.0483.283±0.1442.283±0.0912.782±0.0555.221±0.105D1.671±0.1912.891±0.3635.561±0.0613.317±0.2374.646±0.5908.586±0.366E1.324±0.2152.386±0.1653.229±0.1152.692±0.5382.947±0.5385.441±0.263F值25.88542.360217.88011.51121.857447.260P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

表2 不同浓度雌二醇作用后对照组及羊膜组子宫内膜基质细胞PCNA mRNA相对表达量

组别对照组24h48h72h实验组24h48h72hA1.001±0.4412.007±0.0673.503±0.3281.860±0.6533.002±0.1294.592±0.350B1.670±0.0823.256±0.1334.477±0.0932.730±0.0834.718±0.2095.408±0.150C1.780±0.0053.068±0.6404.417±0.1332.560±02632.782±0.0555.648±0.250D3.635±0.1435.671±0.1676.067±0.0265.434±0.1976.547±0.4397.630±0.141E1.986±0.1453.414±0.7374.372±0.1642.465±0.2044.422±0.4255.297±0.115F值514.869604.630106.829241.69671.008128.073P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

图2 生长曲线

2.1 细胞形态及细胞鉴定 子宫内膜基质细胞大小不一，细胞接种后2 h开始贴壁，12 h后开始生长延伸，24 h后细胞出现明显增殖，呈类成纤维细胞形态，两头尖中间稍宽，呈纺锤状。4～5 d融合度可达80%～90%，8～9 d出现凋亡迹象，可传至7～10代，见图1A、1B。羊膜支架上的子宫内膜基质细胞接2 h后开始贴壁，与普通培养基中的子宫内膜基质细胞比较，形态更细长，贴附更强，生长状态更好，细胞之间连接更紧密，但细胞排列不规则，细胞拉伸延长并相互交织成网状，见图1C、1D，10 d左右羊膜支架出现皱缩趋势。免疫细胞化学染色法证实培养的细胞表达波形蛋白阳性，胞质呈棕黄色；PBS作为一抗时阴性，胞质未着色，胞核呈蓝紫色，可证实培养的为子宫内膜基质细胞，见图1E、1F。

宫腔粘连作为目前女性继发不孕的第二大病因，是严重影响生育期女性生殖健康的常见疾病之一。TCRA为治疗IUA的标准术式，术后虽辅以人工周期及物理屏障介质等，但因宫腔创面大，残留正常内膜组织较少，手术创面易形成纤维瘢痕愈合造成再粘连的发生。重度IUA再粘连率高达62.5%,妊娠成功率仅22.5%～33.3%，宫腔粘连及宫腔镜术后再粘连棘手且亟待解决。

3 讨论

(3) 发动机航行速度增大时, 发动机的比冲先增大后减小. 此外, 发动机内部气相的体积分数分布情况也与航行速度有关.

图3 不同浓度雌二醇作用对照组及羊膜组子宫内膜基质细胞增殖

A：接种后24 h；B：接种后48 h；C：接种后72 h；与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

图4 不同浓度雌二醇作用后对照组及羊膜组组子宫内膜基质细胞PCNA mRNA相对表达量

A：接种后24 h；B：接种后48 h；C：接种后72 h；与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

羊膜因具有免疫原性低、减轻炎症反应、分泌生物活性物质、抑制纤维组织增生、干细胞分化的多潜能性等特性[7]，在眼科及烧伤科的应用可促进上皮修复及减少瘢痕增生[8]。羊膜也被应用于阴道成形术、宫颈形成及剖宫产术后切口修复等。近年来国内外学者尝试将羊膜用于在宫腔粘连，王欣等[9 -10]将羊膜包裹于Foley 球囊表面，放入TCRA后的宫腔内，再粘连率减低并明显改善月经量且增加妊娠率，显示了羊膜在治疗IUA的前景。本研究提示羊膜支架上ESCs的增殖率及PCNA mRNA表达均高于同浓度雌激素时普通培养基上细胞水平，羊膜可通过促进ESCs的增殖促进损伤子宫内膜的修复。由于Foley 球囊与宫腔形态不一致，不能完全阻隔创面，且可造成局部内膜受压坏死，设想将羊膜包裹于宫型球囊表面置于宫腔更有利于子宫内膜修复。

综上所述，本文主要简单分析新医改对医院会计制度和改革的影响。从文中可以得出，在新的医疗改革背景之下可以有效的促进对医院会计制度的改革，对医院会计制度的改善能够更好的推动医院各项费用的核算，对促进医院的发展具有重要的意义。

子宫内膜细胞由上皮细胞和基质细胞组成，基质细胞对上皮细胞的发育、生长和功能方面发挥着重要的作用，因此ESCs对子宫内膜的修复起决定作用。增生期子宫内膜以ESCs为主，我们收集增生期内膜提高了ESCs的产量及纯度。PCNA 是真核生物复制复合体的核心成分，通过不同调控方式与多种细胞因子作用，参与了DNA损伤修复、细胞周期调控及凋亡等重要的细胞事件，已成为评价细胞增殖的常用指标[11]。

雌激素促进子宫内膜细胞有丝分裂，刺激残存的子宫内膜增殖，加快裸露区的上皮化防止粘连发生。但雌激素用量及时间尚不能统一，临床用量1～16 mg不等。Vollmert et al[12]认为宫腔重度粘连术后子宫内膜严重缺损，对雌激素反应降低，大剂量雌激素才可达到促进内膜修复的有效剂量。然而，成九梅 等[13]发现高雌激素状态可使血清转化生长因子-β1 (TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I)等成纤维细胞生长因子升高，使子宫内膜纤维化而加重宫腔粘连。本研究显示雌二醇可促进ESCs增殖且不随着浓度的升高而升高，而是以1×10-6 mol/L浓度时最高；随着雌激素作用时间延长，ESCs的增殖率及PCNA mRNA表达增高；羊膜支架上ESCs增殖优于普通培养基上，说明羊膜可促进子宫内膜的修复且羊膜移植术后雌激素无需减量。现临床雌激素给药途径多样化，阴道用雌激素局部血药浓度高，全身影响小，表现了极大的优势，TCRA术后阴道用药或可减轻药物副作用。

综上所述，羊膜联合适宜剂量的雌激素应用可促进ESCs的增殖，加快损伤子宫内膜的修复，但过高的雌激素环境是无益的。本研究为羊膜及雌激素在预防宫腔粘连的临床应用提供理论依据。然而，女性性激素分泌受垂体-下丘脑-卵巢轴的调节，本实验结果有待动物实验的验证；羊膜为外来的载体，其修复组织的机制尚未明确，且该技术尚不成熟；羊膜移植及雌激素用量对子宫内膜容受性及妊娠结局的影响更有待进一步深入研究。

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