骨转移是许多恶性肿瘤的终末期并发症，其中多达65%～75%的晚期前列腺癌患者罹患骨转移，且确诊骨转移后的中位生存时间仅为12～53个月[1]。调控肿瘤细胞转移的基因一直被广为研究，其中p53已被证实能够促进细胞凋亡、衰老、调节细胞周期。野生型p53(wild-type p53, WT-p53)因突变而导致功能丢失，影响了多种癌症的发生和发展[2]。p53能够通过调节癌细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和肿瘤干细胞特性抑制其迁移和侵袭[3]。EMT是肿瘤细胞发生转移的关键步骤之一，而WT-p53正是通过调节E-cadherin、Snail、Slug、ZEB1/2等EMT相关的转录因子来发挥作用[4]。肿瘤干细胞是整个肿瘤中具有自我更新能力、可以永生化增殖和成癌的一类异质细胞系，这些功能被定义为“干细胞特性”(简称干性)[5]。越来越多的证据[3,6]表明，癌细胞的干细胞特性与肿瘤的转移密切相关，而p53则可通过调节相关基因的表达来调节癌细胞的干细胞特性。该前期研究[7-8]已经证明miR-145能够通过抑制癌细胞的EMT和干性来抑制前列腺癌的骨转移。现已知miR-145由WT-p53直接调控[9]，由此推断：WT-p53基因可能在前列腺癌细胞的EMT和干性转化过程中发挥了重要的调节作用，而miR-145则中介了WT-p53的这一功能。该文针对该假说进行验证，最终证明WT-p53抑制了PC-3细胞的EMT和干性，miR-145则反向调节了WT-p53对前列腺癌细胞EMT和干性的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 骨转移性前列腺癌细胞系PC-3(美国典型培养物保藏中心)；在含有10%胎牛血清的F-12培养基中培养和扩增(美国HyClone公司)。细胞在孵育温度37 ℃并含5% CO2的培养箱中培养。

1.1.1 质粒和瞬时转染 WT-p53和抗-miR-145的表达质粒(广州锐博生物有限公司)。转染前将2×105个细胞接种到6孔板中无血清培养24 h。使用Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)进行转染。转染4～6 h后去除转染培养基，将细胞置于含10%胎牛血清的培养基中培养48 h后进行下一步实验。

对于高校层面来说，要将人才培养的规模扩张逐渐向优化人才培养结构方面转化，需要克服扩张规模的冲动，要根据自身学科的基础以及所具有的办学条件，充分结合当地的经济产业结构以及政府的人才规划来优化人才培养的结构，培养多样化、复合型的人才，这是值得深度思考以及认真研究去解决的课题。作为高校，首先要有这方面的整体考虑，作为思想基础，以后才有可能去采取措施来切实地保障优化结构的目标实现。

以建设低碳社区[30]为要求及目标，重点对位于发展调控区内的乡村旅游发展空间单元进行建设地块划分，并从开发强度控制、自然环境保障、低碳建筑建设，低碳技术运用和低碳生活方式等方面进一步加强引导和控制，以降低旅游发展空间对于生态效益带来的不利影响与干扰。开发控制体系采用强制性、指导性相结合原则，控制指标分为规定性指标和引导性指标，从法律效力和政策层面对控制内容区别对待。

在教学中，学生思维的可视性一直是评价教学过程的重要指标之一。在本课教学中，将思维导图的建构设置为贯穿课堂始终的重要线索。从现象到本质，从个案到共性，学生通过比较、抽象、归纳、总结等科学思维活动，建构起本课的思维导图。

1.1.2 实时荧光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR) 该方法按照ALL-IN-ONETM的miRNA定量RT-PCR检测试剂盒的说明书进行。总RNA使用RNeasy试剂盒(美国Qiagen公司)从细胞中提取。通过添加多聚A序列逆转录所有样本，并用特定的引物对WT-p53和HSA-miR-145进行RT-PCR分析。每个样品设3个复孔，U6设为内参。重复3次并用Schmittgen和Livak的2-ΔΔCT方法计算目的基因的相对表达量[10]。

1.2 Western blot分析 将细胞接种在6孔板中培养，待24～48 h后细胞融合至60%～70%时，在各培养孔中加入样品缓冲液[62.5 mmol/L的Tris-HCl(pH6.8)，2% SDS，10%甘油，5%β-巯基乙醇]。各泳道中加入等量样品蛋白并通过SDS-聚丙烯酰胺电泳分离。将分离过的蛋白质转移到PVDF膜(美国Millipore公司)后，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，并与一级抗体(1 ∶1 000)4 ℃过夜进行结合。膜在TBS-T缓冲液洗涤3次(每次10 min)，并在室温下与二级抗体结合40 min，再次TBS-T洗涤3次后ECL系统化学发光、显影。

已有充分的研究[7-8]证明了miR-145可以抑制前列腺癌的骨转移，并参与调节EMT和前列腺癌细胞的干性，但其上游控制基因尚未有效阐明。而本研究显示，不但WT-p53能够抑制PC-3细胞的迁移、侵袭、EMT和肿瘤球形成，而且其上述抑制作用能够由抗-miR-145阻断并扭转。由此得出结论：WT-p53能够至少一部分通过调控miR-145以抑制肿瘤细胞的EMT和干性。

1.4 侵袭功能检测 侵袭功能使用涂有基质胶(Matrigel，美国BD Biosciences公司)的8 mm孔径Transwell小室(美国Corning公司)系统进行检测。将细胞制备成单细胞悬液并置于无血清培养基中，将1.5×105个细胞加入到上室中，下室填充含10%胎牛血清的培养基。培养箱孵育24～48 h后，将穿过多孔膜的细胞用4%多聚甲醛固定并苏木精染色，显微镜(×100)下计数细胞。

1.5 黏附实验 将50 μl纤连蛋白(50 μg/ml)加入96孔板各孔，培养箱中加热1h以包被，并用1%胎牛血清白蛋白封闭。将悬浮细胞以1.5×104个/孔的密度接种到各孔中。温育30 min后洗除非贴壁细胞，将贴壁细胞用4%多聚甲醛固定，苏木精染色及显微镜(×100)下计数。

2.1 WT-p53能够抑制PC-3细胞的侵袭能力 本研究将高表达WT-p53的质粒转染进入PC-3细胞中，并通过RT-PCR和Western blot分别验证转染成功(图1，F=117.8，P<0.01)，以备进一步实验。在功能学实验中，本研究显示WT-p53高表达的PC-3 细胞，其侵袭能力较对照组下降了45.7%(图2，F=40.18，P<0.05)，而黏附能力却增加了2.87倍(图3，P<0.01)。同时，WT-p53高表达的PC-3细胞使划痕愈合的速度也显著低于对照组(图4，F=379.08，P<0.05)。

2.2 WT-p53抑制了PC-3的EMT而抗-miR-145可逆转此作用 E-Cadherin作为上皮细胞的标记蛋白之一，往往在细胞发生EMT时表达减少。但本实验中WT-p53在PC-3细胞中高表达时，E-cadherin的表达量也相应增加。而Fibronectin和Vimentin等作为间充质细胞的标志物，在EMT过程中往往表达增加。而本实验中WT-p53在PC-3细胞中的表达增加时，此二者的表达被显著抑制(图5)。此外，本研究还观测到PC-3的细胞形态与EMT特性密切相关：随着WT-p53基因的表达水平增高，PC-3细胞的形态从棒状或长梭形的间充质细胞形态，逐渐转化为鹅卵石状或短纺锤形的上皮细胞形态(图6)。

本研究上调PC-3中WT-p53的表达量后，再转染miR-145的反义抑制序列(抗-miR-145)。结果表明：抗-miR-145不仅能够下调WT-p53的表达(图1，F=117.8，P<0.01)，还能阻断其功能，表现为PC-3的迁移速度和侵袭能力明显增加，黏附能力显著降低(图2～4，F=40.18，P<0.05)。

2 结果

1.6 成球实验 将各组细胞(500个/孔)接种到6孔板(美国Corning公司)中，在无血清的DMEM-F12(美国Bio Whittaker, Lonza公司)中悬浮培养，培养液中补充B27(1 ∶50，美国Invitrogen公司)，EGF(20 ng/ml，美国BD Biosciences公司)，胎牛血清白蛋白(0.4%)、胰岛素(4 mg/ml)(美国Sigma公司)。培养10～14 d后，于显微镜下计数PC-3细胞球(紧密、球形、非粘附状态且直径>50 μm)的数量。细胞球形成率(%)=集落数/接种细胞数×100%。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验数据以表示，两组间差异比较用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 p53高表达和miR-145低表达对PC-3细胞中p53表达水平的影响

A：p53单独转染和p53/抗-miR-145共同转染的PC-3中p53的mRNA表达水平；B：p53单独转染和p53/抗-miR-145共同转染的PC-3中p53的蛋白表达水平；与对照组比较：**P<0.01；与单独转染p53组比较：##P<0.01

图2 p53高表达和miR-145对PC-3细胞侵袭相关细胞生物学行为的影响 亚甲兰染色×100

A：显微镜下各组细胞穿破matrigel胶及transwell膜能力对比；B：各组细胞计数；与对照组比较：*P<0.05；与单独转染p53组比较：#P<0.05

2.2 行为生活方式频率分布 社区居民的主要不良行为生活方式有偶尔吃早餐(4.1%)、每天新鲜蔬菜食用小于300 g(15.9%)、经常吃饱晚餐(14.6%)、缺乏运动(从不或偶尔运动占27.0%和每天静坐5～<8 h占20.9%)、睡眠时间小于5 h(11.6%)、吸烟(15.2%)、饮酒(13.3%)，见表2。

与此同时，另一段喝酒小视频开始在京城年轻人的朋友圈刷屏。他们一口气喝完一杯名为“地球最后的夜晚”的烈酒，然后大声念出片中台词：“你数过天上的星星吗？它们像小鸟一样，总在我胸口跳伞。”把这段视频发到朋友圈，就可以免单。这是Mandrill酒吧老板，兼《地球》主演黄觉推出的活动。看《地球》加喝“地球”成为潮流，顺势带动了网上的“地球”酒杯代购生意。

图3 p53高表达和miR-145对PC-3细胞粘附能力的影响 亚甲兰染色×40

A：p53显微镜下各组细胞粘附能力的差异；B：各组细胞计数；与对照组比较：**P<0.01；与单独转染p53组比较：##P<0.01

2.3 抑制miR-145的表达能够阻断PC-3细胞中WT-p53的作用 如图5所示，在WT-p53高表达的状态下，抗-miR-145减少了上皮细胞标志物E-Cad-herin的表达，恢复了间充质细胞标志物Vimentin和Fibronectin的表达水平；同时也使得PC-3细胞由间充质细胞形态向上皮细胞形态转换，见图6。

图4 p53高表达和miR-145低表达对PC-3细胞迁移能力的影响 ×40

A：显微镜下各组细胞迁移能力的差异；B：划痕愈合速度定量；与对照组比较：*P<0.05；与单独转染p53组比较：##P<0.01

2.4 WT-p53抑制PC-3细胞成球而抗-miR-145可阻断此效果 各实验组的PC-3细胞在非黏附条件下培养12 d之后，所有实验组有癌细胞球形成，球体形成率分别是4.8%(对照组)和2.3%(PC-3/WT-p53)，这说明WT-p53能够抑制前列腺癌细胞形成非黏附球体(F=70.18，P<0.01)，见图7。更为重要的是，本研究还显示抗-miR-145完全逆转了WT-p53抑制成球的能力，使PC-3/WT-p53/抗-miR-145实验组的成球率较PC-3/WT-p53实验组提高了6.7%。

3 讨论

1.3 划痕实验 PC-3细胞均匀接种到6孔板中使之在24 h内达到完全融合。无血清饥饿24 h后，用无菌100 μl吸头的尖端进行划痕，PBS洗涤2次，并在含10%胎牛血清的培养基中培养。分别在0、24 h的时间点拍摄PC-3细胞迁移及划痕愈合的图像(×40)。

在《战争宣言》中，括号里齐唱的部分要表达的实际是“一旦下达作战命令就能马上提振士气、奔赴战场”的含义；几家西方媒体将其译为指称意义对等的“kill,kill,kill”看似是忠实于原文的翻译，但并未正确传达其情感意义，事实上是对文本进行了干涉，并不“客观公正”。

图5 各组细胞表达EMT特征蛋白的差异

图6 各组细胞形态差异 ×200

图7 p53通过调控miR-145抑制PC-3细胞的肿瘤球形成能力 ×200

A：PC-3对照组、p53转染组、p53/抗-miR-145共转组各自的肿瘤球形态；B：各组细胞的成球率;与对照组比较：**P<0.01；与单独转染p53组比较：##P<0.01

许多研究[11-12]已经证明，WT-p53基因除在调节细胞周期、细胞凋亡、衰老、DNA修复和自噬时发挥关键作用外，在调节肿瘤细胞转移的机制中也起着至关重要的作用。有研究[11]显示，p53和Rb发生联合缺陷可能是使前列腺发生高侵袭度和高转移度恶变的关键因素之一。此外，前列腺上皮细胞中PTEN/TP53的缺失也导致了其向多能祖细胞转化和EMT化，恶性度增加[12]。这些发现均提示前列腺细胞中WT-p53的功能缺失可能通过提高细胞迁移能力、侵袭能力、EMT和干性以促进前列腺癌的发展和转移。

更为重要的是，本研究还发现p53除上述途径外，还可通过调节肿瘤细胞中microRNA的表达水平来发挥抑癌作用。已有类似的研究[13]证明，WT-p53的功能缺失导致miR-34a的表达量下降，而后者是Snail的直接靶向抑制因子，因此造成Snail依赖性的EMT在结肠癌、乳腺癌和肺癌细胞中被激活。这支持了本研究结论：不仅上调WT-p53能够增强PC-3细胞中的miR-145表达水平，抗-miR-145也能够逆转由WT-p53抑制的PC-3细胞的EMT特性。这说明miR-145在WT-p53调控EMT和干性的过程中充当了中介作用。

已有研究[14]显示WT-p53能够抑制前列腺癌细胞中N-cadherin和ZEB2的表达，后两者均是miR-145的目标靶基因，且均是EMT的转录因子。WT-p53对PC-3细胞中N-cadherin和ZEB2的抑制作用也均能够被抗-miR-145逆转。因此本研究推测，miR-145可能通过对N-cadherin和ZEB2的抑制来介导WT-p53对PC-3 细胞EMT的调节。

除了调控EMT之外，microRNA还可以作为p53的直接抑制靶基因以调节其抑制癌细胞干性的作用，例如p53可以通过调控miR-200c来调节KLF4和BMI1[3]。本研究之前的结果已经证明miR-145通过抑制CD44、Oct4、c-myc和Klf4以抑制PC-3细胞的干性[8]，而本研究显示，抗-miR-145还能够逆转WT-p53对PC-3细胞成球的抑制，这说明miR-145除了本身可以靶向抑制干性相关蛋白之外，还能够介导WT-p53调节癌细胞干性的功能。

最近的研究[15]表明，癌细胞发生EMT后可以产生干细胞特性，这一重要发现意味着EMT和癌症干细胞存在直接联系，也支持了本研究的推测：p53/miR-145通路可能是PC-3细胞EMT和干性之间的一个新纽带，今后可以从此方面入手，研究生物小分子对于肿瘤发生发展的影响。本研究结果表明，WT-p53通过部分调节miR-145以抑制PC-3的迁移、侵袭、EMT和干性；不仅如此，WT-p53的功能缺失可能会造成miR-145的表达量下降，导致前列腺癌的EMT和干性增强，从而促进骨转移。因此，研发出针对p53/miR-145调控轴的靶向药物，可能成为治疗前列腺癌骨转移的一种有效手段。

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