口腔中定植了大量细菌，龋病、牙周病等常见口腔疾病均与口内致病菌有关。人们一直寻求消灭口内致病菌的有效方法，以此来预防这些口腔疾病的发生[1-2]。传统的口内去除细菌方式主要通过机械去除牙菌斑或者使用广谱抗生素。然而，机械去除牙菌斑只能暂时除菌。使用广谱抗生素也有耐药性和广泛杀菌的问题[3]。因此，该实验致力于寻求新型抗菌剂来有效杀灭敏感致病菌，并且对正常菌群无负面影响，保证口腔中的菌群平衡。该研究合成了一种新型抗菌肽C8gpm11。通过C8gpm11对口腔常见致病菌的作用来分析其抑菌杀菌能力，并观察细菌表面形态的改变，研究其杀菌机制，明确临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株及其生长条件 本实验所需菌株见表1，主要是由ATCC菌株和实验室菌株(第四军医大学)组成。变异链球菌(变链菌)(Streptococcus mutans)UA 140、UA 159、血液链球菌(血链菌)(Streptococcus sanguinis)ATCC 10556、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212在BHI (Difco, Detroit, MI)培养基中。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) ATCC 4356在MRS(Difco, Detroit, MI)培养基中。各菌株37 ℃厌氧(80% N2, 10% CO2，10% H2)隔夜培养至109 CFU/ml，再用BHI培养基稀释至105 CFU/ml备用。

1.2 多肽制备 将多肽C8gpm11(上海生工合成)溶解在无菌超纯水中，配制成终浓度为40.62 mg/ml的溶液浓度溶解，置于-20 ℃保存。

1.3 最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericide concentration concentration，MBC)测定 采用二倍稀释法对MIC和MBC进行测定[临床实验室标准化委员会(CLSI)][4]。稀释后不同浓度C8gpm11溶液按梯度依次加入96孔板，用同等量无菌超纯水取代C8gpm11作阴性对照。将新鲜待测菌液(105 CFU/ml)依次加入梯度浓度C8gpm11及无菌超纯水中至总容量200 μl。37 ℃厌氧培养20～24 h。肉眼观察各孔菌液浑浊情况。MIC值为肉眼观察所有菌液变澄清孔所对应的最低多肽浓度[5] 。取所有澄清孔中的菌液100 μl，分别稀释铺板至固体培养基中培养，置于37 ℃厌氧培养20～24 h。肉眼观察固体培养基菌落长势情况。MBC值为不能观察到固体培养基有菌落生长的最低多肽浓度[5]。各菌种实验重复3次。

苏杭一带的菊花暖锅，火锅汤汁为鸡汤或肉汤，并辅以肉、鱼、鸡等薄生片与菊花一起涮着吃，清香爽神，风味独特。

FBC计算公式：其中MBCA代表单独A制剂MBC值，MBCA/B代表混合制剂中A制剂MBC值，MBCB代表单独B制剂MBC值，MBCB/A代表混合制剂中B制剂MBC值[7]。

1.5 抑菌圈实验 收集无菌唾液[6]。配置C8gpm11三种规格溶液：溶于三蒸水4倍MIC浓度溶液、溶于无菌唾液4倍MIC浓度溶液和溶于三蒸水8倍MIC浓度溶液。将新鲜109 CFU/ml菌液加入软琼脂培养基摇匀，稀释至108 CFU/ml，平铺于琼脂培养基。冷却凝固后，将三种规格溶液各取5 μl依次点在含有细菌的琼脂板上。阴性对照为不含多肽的唾液。孵育1 h后，37 ℃厌氧培养24 ～ 48 h。使用十分度游标卡尺测量抑菌圈直径。各菌种实验重复3次。

1.6 部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)、部分杀菌浓度(fractional bactericide concentration，FBC)测定

经单因素方差分析，统计量F值分别为变链菌UA 159：73.353，变链菌UA 140：52.642，血链菌：74.050，粪肠球菌：25.335，嗜酸乳杆菌：33.805，牙龈卟啉单胞菌：60.396。即各菌种三组数据不全相等，差异有统计学意义(P<0.05)。三组数据两两比较，使用Tukey HSD检验。除嗜酸乳杆菌水溶4倍MIC浓度和水溶8倍MIC浓度数据差异无统计学意义(P=0.21)、牙龈卟啉单胞菌水溶4倍MIC浓度和唾液溶4倍MIC浓度数据差异无统计学意义(P=0.09)以外，其余各菌种三组数据两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

1.6.2 FIC和FBC测定 NaF(或CHX)和C8gpm11分别稀释成梯度浓度。将对应梯度浓度的NaF(或CHX)和C8gpm11溶液分别加入96孔板同一孔中配成混合制剂。在NaF和C8gpm11混合制剂中，NaF浓度范围为0.125～16 g/L, C8gpm11浓度范围为1～128 μg/ml。在CHX和C8gpm11混合制剂中，CHX浓度范围为0.012 5～1.6 mg/L，C8gpm11浓度范围为0.5～64 μg/ml。阴性对照为不含NaF(或CHX)和C8gpm11的无菌超纯水。加入变链菌UA 159菌液(105 CFU/ml)至每孔200 μl，37 ℃厌氧培养20～24 h。

2.3 抑菌圈测定结果 抑菌圈测定结果见图2和表2。水溶4倍MIC浓度抑菌圈略大于唾液溶4倍MIC浓度抑菌圈。水溶8倍MIC浓度抑菌圈略大于水溶4倍MIC浓度抑菌圈。多肽C8gpm11在不同条件下抑菌圈大小略有差异。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析。数据采用表示，并且采用单因素方差分析进行处理，组间两两比较采用Tukey HSD检验。检验水准α=0.05。

1.4 扫描电镜观察多肽对细菌作用 取对数期变链菌UA 159、血链菌新鲜菌悬液于4 ℃、4 500 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗涤3次。C8gpm11(最终浓度为4倍MIC浓度)室温处理细菌悬液(100 μl)24 h。4 ℃、4 500 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗涤3次，2.5 %戊二醛固定4 h，乙醇梯度脱水(50%-70%- 80%- 90%-95%-100%-100%), 标本在每个梯度内浸泡15 min。获得完全脱水的细菌沉淀，梯度降温(-20 ℃～ -40 ℃～ -80 ℃)，细菌沉淀置于冷冻干燥机中冻干。扫描电镜观察。取C8gpm11处理过的菌液5 μl稀释到100 μl，铺板，37 ℃厌氧培养48 h，观察是否有菌落生长。阳性对照为未经C8gpm11处理的细菌，其余步骤同上。

由图3可知，当采用光滑轮胎进行试验时，摩擦系数的大小仅取决于轮胎与试件表面的接触面积，AC—13属于悬浮密实结构类型，表面构造深度较小、与轮胎的接触面积大，从而有较高的摩擦系数。对于花纹轮胎而言，都是OGFC—13的摩擦系数最大，主要是因为轮胎花纹能够嵌入到路面宏观纹理中，增强轮胎与路面的嵌挤力，表现为较好的抗滑性能。

现有的师生课堂互动模式并不能很好地促进语文课堂的教学效果，出现这种情况的主要原因是教师的主观因素影响，使这种课堂教学模式与传统“填鸭式”课堂教学模式起到的效果没有什么区别。因此，现阶段想要建立合理的课堂互动模式就要在传统课堂互动模式的基础上进行改革，多给学生之间交流的机会，使学生主动发现在课堂教学中比较关键的知识，然后再进行合理的课堂讨论得出学生认为的最佳答案，教师在从旁辅助就可以，这样模式取得的学习成果学生才会掌握的最扎实。

对于不规则地貌，其表面积很难通过常规的方法来计算。目前，通常使用不规则三角网法提取地面和地物坐标信息，并进行拟合求解。CASS9.0软件表面积计算是通过DTM(Digital Terrain Model，DTM)建模，在三维空间内将高程点生成为带坡度的三角网，进行后续表面积的拟合计算[9]。通过实地测得的地面特征点三维坐标(X，Y，Z)数据生成三角网来计算拟定设计高程下每个三角形的表面积，叠加得到指定区域的总表面积。

2 结果

2.1 MIC和MBC测定结果 MIC、MBC结果见表1。C8gpm11对6种口腔微生物MIC值范围为64～256 μg/ml，MBC值范围为128～>256 μg/ml。变链菌UA 159和嗜酸乳杆菌各自MBC值均是MIC值的两倍。变链菌UA 140、血链菌和牙龈卟啉单胞菌各自MIC值和MBC值相等。粪肠球菌MBC值未测出。变链菌不同亚型(UA 159和UA 140)菌种MIC值和MBC值不完全相同。

表1 多肽C8gpm11的抗菌能力(μg/ml)

名称MICMBC变链菌UA15964128变链菌UA140128128血链菌128128粪肠球菌256>256嗜酸乳杆菌128256牙龈卟啉单胞菌256256

2.2 扫描电镜观察多肽对细菌作用结果 电镜下结果见图1。观察细菌细胞膜形态变化。未经C8gp11处理的细菌(A、C)表面光滑，形态完整，细胞膜无破碎。经4倍MIC浓度C8gpm11处理的细菌(B、D)形态不完整，细胞膜的完整性遭到破坏。C8gpm11处理后变链菌UA 159表面形态发生改变，表型轮廓模糊，以及细胞膜呈现微孔样改变。此外，C8gpm11处理后细菌,铺板培养均无菌落生长。

FIC(或FBC)≤0.5 表示抗菌药物和C8gpm11有协同抗菌作用；0.54.0表示有拮抗作用[7-8]。

卵巢囊性病变是一组含有囊性特征的瘤性或瘤样病变发生在卵巢位置的疾病总称，临床统计显示，该病变类型在卵巢多种病变类型中约占60%～70%[1]。卵巢囊性病变的临床表现与其他病变类型相比没有明显的特征，通常需要通过影像学进行诊断及鉴别诊断，而作为筛查手段的B超很难准确判断病灶的性质及其分布范围。因此，磁共振（以下简称MR）检查就成为了卵巢囊性病变主要的诊断方式[2]。为探究卵巢囊性病变不同类型的MR特征，本文将选取我院2017年1月—2018年7月间收治的100例卵巢囊性病变患者作为主要研究对象，开展实验。具体研究报告如下。

FIC计算公式：其中MICA代表单独A制剂MIC值，MICA/B代表混合制剂中A制剂MIC值，MICB代表单独B制剂MIC值，MICB/A代表混合制剂中B制剂MIC值[7]。

图1 C8gpm11(4倍MIC)处理后扫描电镜图 ×20 000

A：变链菌对照组；B：变链菌处理组；C：血链菌对照组；D：血链菌处理组

图2 抑菌圈测定结果

A：变链菌UA 159；B：变链菌UA 140；C：血链菌；D：粪肠球菌；E：嗜酸乳杆菌；F：牙龈卟啉单胞菌；Ⅰ行：溶于三蒸水4倍MIC浓度溶液；Ⅱ行：溶于唾液4倍MIC浓度溶液； Ⅲ行：溶于三蒸水8倍MIC浓度溶液

表2 5种细菌抑菌圈直径

名称水溶4倍MIC直径唾液溶4倍MIC直径水溶8倍MIC直径变链菌UA1597.70±0.107.20±0.108.00±0.10变链菌UA1407.47±0.067.13±0.127.83±0.06血链菌7.83±0.067.47±0.128.33±0.06粪肠球菌7.33±0.067.00±0.007.70±0.20嗜酸乳杆菌8.13±0.127.50±0.178.37±0.15牙龈卟啉单胞菌6.93±0.066.70±0.107.57±0.15

1.6.1 NaF和CHX 的MIC和MBC测定 NaF或CHX梯度稀释后分别加入96孔板，用同等量无菌超纯水取代NaF或CHX作为阴性对照，将变链菌UA 159菌液(105 CFU/ml)依次加入梯度浓度NaF或CHX及无菌超纯水中至总容量200 μl。NaF浓度范围在0.125～16 g/L，CHX浓度范围在0.05～6.4 mg/L，37 ℃厌氧培养20 ～ 24 h。MIC值、MBC值测定见前述。

2.4 FIC和FBC测定结果 C8gpm11、NaF和CHX单独MIC、MBC值以及NaF(或CHX)和C8gpm11混合制剂FIC、FBC值见表3。在协同性研究中，C8gpm11和NaF联合抗菌FIC值为1.125，FBC值为0.625，FIC值和FBC值均大于0.5。C8gpm11和CHX联合抗菌FIC值为0.312 5，FBC值为0.312 5，FIC值和FBC值均小于0.5。

第一，行政隶属关系导致政策不统一。传统的行政划分形成了“区位差距”和“政策壁垒”，三地的教育主管部门制定政策，高校师资培训中心按照政策执行，属地化的政策差异导致一些工作不能协同，缺乏整体统一的规划。例如，北京市教委出台政策，拥有博士学位或者具有副教授和教授职称的高校教师，可以免修岗前培训课程，直接认定教师资格证。天津仍沿袭传统的政策，认定高校教师资格需参加岗前培训。而河北省教育厅刚调整了认定高校教师资格考试的政策，规定了岗前培训的成绩等同于教师资格认定考试成绩。三地间没有形成一个统一的认定政策。

表3 C8gpm11和NaF(或CHX)协同抗菌作用研究

名称MIC/MBC单独抗菌联合抗菌▲FIC/FBCC8gpm11(μg/ml)64/1288/161.125/0.625NaF(g/L)1/41/2C8gpm11(μg/ml)64/1284/80.3125/0.3125CHX(mg/L)0.4/0.80.1/0.2

▲联合抗菌指C8gpm11和NaF(或CHX)混合制剂

3 讨论

口腔黏膜和牙齿表面定植细菌主要有三个特点：定植在牙面形成生物膜；通过机体代谢产酸；对酸性环境有一定的耐受性[9]。在以往实验中，实验者往往寄希望于预防细菌在牙面的定植[10]。但是这种方式并不能完全杀灭细菌，牙面仍有再次感染的风险[11]。近年来Eckert et al[12]提出了一种新型抗菌剂概念：STAMP[specifically (or selectively) targeted antimicrobial peptides],并且通过实验证明了STAMP的可行性。感受刺激多肽(the competence stimulating peptide,CSP)(SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK)的受体结合区域是一种可以针对变链菌的STAMP多肽区域。Eckert et al[11]合成的CSP衍生物C16G2，其可以抑制变链菌细胞分裂最终导致细胞凋亡。C8(TFFRLFNRG)为CSP的 C端8个氨基酸。Pm11是一种新型优化多肽[13]，该多肽可以作用于细菌细胞膜流体双分子层，在细胞膜表面“打孔”，形成离子通道。这些小孔使细胞质内容物大量外渗，最终导致细菌死亡[14]。由C8、Pm11和链接部结合形成的新型多肽即本实验所用C8gpm11。变链菌对C8gpm11的敏感性应较其余细菌更强。

MIC、MBC测定结果显示变链菌UA 159 MIC值是所有细菌中最小数值。表明其抑菌、杀菌作用效果最好，敏感性最强。C8gpm11对上述口内致病菌均有抑菌、杀菌作用(粪肠球菌杀菌作用较差，表明粪肠球菌对其敏感性较弱)。C8gpm11对不同致龋菌、同种菌不同亚型的抑菌、杀菌作用效果均有差别。这可能与细菌细胞膜的结构差异有关。

电镜下结果可以肉眼观察细菌细胞膜形态变化。C8gpm11处理后的变链菌UA 159形态发生改变，表型轮廓模糊，以及细胞膜呈现微孔样改变。血链菌细胞表面形态改变没有变链菌明显，表明C8gpm11对血链菌作用效果没有变链菌UA 159明显。目前认为有两种杀菌机制：一是多肽可在不损害细菌细胞膜的同时抑制核酸和蛋白质的合成；二是阴阳离子募集多肽至细菌细胞膜表面，穿透细胞膜脂质双分子层，使细胞膜局部形成孔隙，最终发挥杀菌效果[14]。

车近十堰市，“问道武当”的广告标牌就不断映入眼帘。武当山又名太和山，这正是十堰市太和医院（以下简称“太和医院”）得名的来源。

抑菌圈结果表明除嗜酸乳杆菌外，其余菌种水溶8倍MIC较水溶4倍MIC直径略大。表明C8gpm11抗菌效果呈现一定浓度依赖性。浓度相对越高，抗菌效果越好。口腔环境以及唾液成分复杂，抗菌多肽可在唾液蛋白酶的作用下被分解成氨基酸，丧失活性。抑菌圈结果表明除牙龈卟啉单胞菌外，其余菌种唾液溶4倍MIC较水溶4倍MIC直径略小。表明溶解在唾液中的C8gpm11活性虽然略有降低，但依然具有较强的抗菌能力。Watnick et al[15]研究证明，抗菌剂对浮游态的细菌具有更好的杀菌效果。但在口腔环境中，细菌多以生物膜形式定植繁殖，所以，C8gpm11对口内以生物膜形式存在的细菌是否具有杀菌能力，还有待进一步实验验证。

在临床实践中，对于耐药菌株，单一抗菌剂不能达到很好的杀菌效果。因此，有必要采用联合抗菌剂杀灭致病菌。C8gpm11和CHX联合抗菌剂FIC值和FBC值均小于0.5，表明C8gpm11和CHX之间具有协同抗菌作用。C8gpm11和CHX联合抗菌剂较单独使用C8gpm11或CHX对口内致病菌杀菌效果应更明显。C8gpm11和NaF联合抗菌剂FIC值和FBC值均大于0.5，因此不能认为C8gpm11和NaF联合使用对于变链菌UA 159具有协同抗菌作用。将C8gpm11和CHX作为一种联合抗菌药物在临床应用中具有良好的前景。

本实验证明了C8gpm11的临床应用潜力，但其临床应用效果和杀菌机制尚需进一步探讨。抗菌肽杀菌方式多种多样，对其确切杀菌机制尚缺乏足够的认识，需要进一步研究。

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