垂体腺瘤是最常见的神经系统肿瘤之一，根据内分泌功能和激素水平，垂体腺瘤可分为无功能性垂体腺瘤和功能性垂体腺瘤[1]。功能性垂体腺瘤的治疗目的是使血清催乳素、生长激素或者肾上腺素水平恢复至正常，肿瘤体积减小或消失。细胞周期进程的调控对机体的正常发育和体内平衡至关重要，有利于维持垂体稳态，防止细胞过度增殖。细胞周期蛋白p21Waf1/cip1和p27Kip1是细胞周期负性调控因子，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关；其表达异常可导致癌症的发生[2]。本研究从2008年1月至2013年12月北京市神经外科研究所收治的临床资料完整的病例中，选取促乳素腺瘤患者46例和生长激素肿瘤患者48例通过构建组织芯片，分析94例功能性垂体腺瘤患者的p21Waf1/cip1、p27Kip1蛋白的表达水平及与临床特征的关系；并观察p21Waf1/cip1和p27Kip1启动子的甲基化水平。现报告如下。

拟流体模型将宏观上离散的颗粒经过空间或时间平均，处理成与连续流体相一样，从流体力学的角度研究两相流动，给出颗粒相和流体相空间分布的详细信息，颗粒相只被处理成一相的拟流体模型又称为双流体模型(TFM)。模拟结果和实测结果容易进行比较，在工程实际中得到了广泛的应用，成为气固两相流发展的主流。两相方程形式统一，可利用单相流流体力学的成果，研究比较成熟，方程求解方便。颗粒间的相互作用通过颗粒压力和黏度来描述，不需考虑颗粒的数量，便于求解颗粒浓度较高的体系。由于采用平均方法处理，对流场内单个颗粒的行为无能为力，且不适用于气固两相流的不均匀流动结构。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组中侵袭性肿瘤36例(侵袭组)，非侵袭性肿瘤58例(非侵袭组)。侵袭性腺瘤的诊断标准：(1)Knosp分级Ⅲ～Ⅳ级和Hardy分级Ⅲ～Ⅳ级；(2)经病理检查证实肿瘤细胞侵犯骨质或邻近硬脑膜；(3)肿瘤细胞侵入蝶窦腔或周围血管和神经。根据世界卫生组织2017年垂体腺瘤组织学分类[3]，垂体腺瘤标本来自北京市神经外科研究所垂体腺瘤生物样本库。另有6例正常垂体标本来自遗体捐献者。本研究得到首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会的批准。

1.2 组织芯片构建 设计5×10点列阵的组织芯片受体模块，选择目标组织并分别在组织切片和相应石蜡组织上标记；用取材针从已定位的石蜡上取目标组织(直径2 mm)到组织芯片受体蜡块的相应孔内。每个样品随机取2处。

在反对分裂主义、维护和推进国家统一的工作中，促进全国各民族、各地区的融合发展虽然是国家主导的理性行为，但是经济社会的融合有赖于各群体及地方的有效参与。这固然与参与的机会与能力有关，但参与的意愿却是一个基础性的要素。在反独固统、反独促统的背景下，参与意愿既是国家认同度的表现，反过来也将影响融合发展的成效及国家认同的建构。

1.3 p21Waf1/cip1和p27Kip1表达检测 采用免疫组化染色法。将组织阵列蜡块行连续切片,切片厚度为4 μm。将切片脱蜡，梯度乙醇水化，室温干燥24～48 h，4℃储存。按Leica公司推荐的全自动染色流程，使用乳腺癌组织作为阳性组织进行试染色。染色流程：碱修复20 min，一抗15 min。一抗浓度：p21Waf1/cip1 (1∶100;Abcam) ；p27Kip1 (1∶100;Abcam)。标本中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，图像采集使用Leica一体化采集系统(APERIO AT2)。染色结果(H-Score评分)用染色强度结合阳性细胞数百分比[H-Score=1(弱阳性)，2(阳性)，3(强阳性)×百分数]评定。按中位数分为低表达和高表达。

1.4 p21Waf1/cip1和p27Kip1启动子甲基化检测 采用CpG岛在线预测网站http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot预测序列潜在的CpG岛。用sequenom©EpiDesigner程序对该序列进行引物设计方案，覆盖转录起始位点G上游5 000和下游1 000个核苷酸。DNA甲基化探针：p21Waf1/cip1上游：GTGAAACTCCATCTCCGCAA；下游：AATCCCTTC-CAGACTCTGCT。p27Kip1上游：GATGGTAGAAATTT-TGGGTTAAGG；下游：CCAACAAACCTACTCTAAC-TAACCTC。扩增PCR反应程序：第一阶段94℃；第二阶段94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共45个循环；第三阶段72℃ 3 min。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。检测结果以均数±标准差表示。p21Waf1/cip1和p27Kip1表达水平与各临床特征的关系用χ2检验和相关分析。

2 结 果

2.1 侵袭组与非侵袭组p21Waf1/cip1、p27Kip1的表达水平 见图1。免疫组化检测显示，侵袭组中高表达p21Waf1/cip1者为8例(22.2%)，H-Score评分为148±28.4；而非侵袭组中高表达者为39例(67.2%)，H-Score评分为217.2±43.2。侵袭组高表达p27Kip1者为10例(27.8%)，H-Score评分为122.1±31.1；非侵袭组高表达p27Kip1者为37例(63.8%),H-Score评分为187.2±36.6。侵袭组p21Waf1/cip1和p27Kip1高表达者的比率均显著低于非侵袭组(χ2=18.01，P=0.000； χ2=11.52，P=0.001)。

[8] Sapochnik M,Nieto LE,Fuertes M,et al.Molecular mechanisms underlying pituitary pathogenesis[J].Biochem Genet,2016,54:107.

甲基化是真核细胞中DNA正常的修饰方式，启动子区CpG岛发生异常甲基化可导致基因转录沉默，使抑癌基因、细胞周期调节基因、凋亡基因等表达失衡，参与肿瘤的发生、发展[20]。本研究发现，p27Kip1启动子的4个CpG位点的甲基化水平，在侵袭组与非侵袭组肿瘤标本之间的差异有统计学意义(P<0.01)；而p21Waf1/cip1启动子甲基化水平的差异无统计学意义。在卵巢癌中，p27Kip1表达受启动子甲基化水平调节，给予5-氮杂-2′-脱氧胞苷去甲基化后能增加其表达水平，并对卡铂、顺铂类药物的敏感性增高[21]。p27Kip1启动子的甲基化可能解释了功能性垂体腺瘤p27Kip1表达水平降低的机制。

[4] Caimari F,Korbonits M.Novel genetic causes of pituitary adenomas[J].Clin Cancer Res,2016,22:5030.

  

图1 侵袭与非侵袭患者及正常者的p21Waf1/cip1和p27Kip1表达水平(免疫组化染色，100×)

 

表1 功能性垂体腺瘤患者p21Waf1/cip1的表达水平与各临床特征的关系(例)

  

组别例数年龄(岁)<40≥40性别男女肿瘤体积(中位数)<4．35cm3≥4．35cm3复发是否侵袭是否高表达组472126222530171235836低表达祖472621281917307402819P值0．3020．2150．0070．1990．000

 

表2 功能性垂体腺瘤患者p27Kip1的表达水平与各临床特征的关系(例)

  

组别例数年龄(岁)<40≥40性别男女肿瘤体积(中位数)<4．35cm3≥4．35cm3复发是否侵袭是否高表达组4725222423291811361037低表达祖472225262118298392621P值0．5360．6790．0230．4410．001

  

图2 p21Waf1/cip1启动子甲基化的检测结果(正常垂体：F08-F12；非侵袭组：E01-E08；侵袭组：E09-E12，F01-F07)图3 p27Kip1启动子甲基化的检测结果(正常垂体：108-112；非侵袭组：H01-H08；侵袭组：H09-H12，101-107)

3 讨 论

细胞周期的各个阶段受细胞周期依赖性激酶(CDKs)的调节，其被细胞周期蛋白激活，并被CDK抑制剂(CDKIs)抑制[5-6]。CDKIs参与保持成人组织静止，在多个类型的肿瘤中存在调控失常[7]。本研究发现，垂体腺瘤患者的p21Waf1/cip1和p27Kip1蛋白表达水平明显低于正常垂体，其表达水平与肿瘤的侵袭行为密切相关。侵袭性腺瘤组的p27Kip1启动子甲基化水平高，促乳素腺瘤的p27Kip1启动子甲基化水平与血清催乳素水平呈负相关。

垂体腺瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene，PTTG)是垂体肿瘤的一个标志性分子，能够促进垂体细胞增殖和垂体肿瘤的发生[8]。PTTG表达失调导致G1/S或者G2/M检查点失常，引起细胞有丝分裂异常，非整倍性和染色体不稳定[9]。p21Waf1/cip1和p27Kip1属于细胞周期素激酶抑制剂CIP/KIP家族的成员，两者N端的氨基酸顺序较为接近，具有高度相似的分子排列和结构；因此二者均能够抑制CDK活性的结合位点[10]。p21Waf1/cip1参与由p53介导的细胞DNA损伤反应，细胞损伤时p21Waf1/cip1表达启动，进而抑制CyclinE-CDK2复合物活性，影响Rb磷酸化水平将细胞停滞于G1期；同时p21Waf1/cip1与结合细胞增殖核抗原抑制DNA复制使细胞生长停滞。研究发现，p21Waf1/cip1在各种肿瘤中的表达水平较低，包括肠腺瘤、皮肤癌和乳腺癌[11]；这表明p21Waf1/cip1可能是肿瘤形成和进展的预测指标。

p27Kip1与细胞周期蛋白E/CDK2或细胞周期蛋白A/CDK2激酶复合物结合，主要功能是作用于细胞周期；一是抑制Cyclin-CDKs和H1组蛋白酶活性；二是抑制Cyclins-CDKs复合物磷酸化的能力[12]。p27Kip1蛋白的减少或缺失，可以作为多种恶性肿瘤预后不良的因素[13-15]。作为肿瘤抑制因子，p21Waf1/cip1和p27Kip1的表达水平降低可能促进肿瘤发生和增殖[16]。p27Kip1敲除小鼠模型引起的垂体腺瘤具有高度突变的可能性，这意味着CDKIs参与了垂体腺瘤的发生[17]。p21Waf1/cip1和p27Kip1缺陷均可以加速p18INK4c-null背景下的垂体肿瘤发生[18-19]。本研究发现，侵袭组肿瘤中p21Waf1/cip1和p27Kip1的表达水平明显低于非侵袭组，而侵袭组的血清促乳素水平高于非侵袭组。相关性分析显示，p27Kip1水平和促乳素水平呈负相关(r=-0.237，P<0.01)；表明p27Kip1抑制促乳素腺瘤生长，对促乳素的释放可能具有抑制作用。

2.3 p21Waf1/cip1和p27Kip1启动子的甲基化水平 见图2、图3。DNA甲基化、组蛋白修饰和MicroRNA调控是当前研究的最多、最成熟的表观遗传学机制[4]。甲基化诱导的基因沉默的研究较为清楚，包括DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂的药物已用于治疗包括骨髓增生异常综合征在内的几种疾病。CpG位点甲基化检测显示，p27Kip1启动子甲基化水平>50%的为7/33，其中4个位点与肿瘤侵袭有关，差异具有统计学意义(P<0.01)；而p21Waf1/cip1启动子甲基化水平>50%的为5/38，与肿瘤的侵袭行为无关。

这处伤口在右腰偏下方向，约有15公分，但伤口又被人用红色丝线很整齐地缝了起来，如同趴了一条巨大的蜈蚣。老马说：“这不是医院缝的，但是缝的人显然很细心。”天气仍然是热，但秦明月徒然感到一阵寒意，他越来越感觉到这事非同小可。老马又说：“这个伤口具体是什么原因还有待检验。”

综上所述，p21Waf1/cip1及p27Kip1的表达水平与功能性垂体腺瘤的肿瘤体积和侵袭行为有显著关系；p21Waf1/cip1、p27Kip1表达水平降低引起肿瘤过度生长，分泌更多的激素加重了临床症状。因此，干预p21Waf1/cip1/p27Kip1表达异常的措施，可能对功能性垂体腺瘤的药物治疗具有潜在的临床应用价值。

[参 考 文 献]

[1] Aflorei ED,Korbonits M.Epidemiology and etiopathogenesis of pituitary adenomas[J].J Neurooncol,2014,117:379.

[11] Topley GI,Okuyama R,Gonzales JG,et al.p21(WAF1/Cip1) functions as a suppressor of malignant skin tumor formation and a determinant of keratinocyte stem-cell potential[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:9089.

[3] Roncaroli F,Scheithauer BW.Papillary tumor of the pineal region and spindle cell oncocytoma of the pituitary:new tumor entities in the 2007 WHO Classification[J].Brain Pathol,2007,17:314.

19世纪晚期，随着汇丰、德华、华俄道胜等银行在中国的发展壮大，以英国为首的西方列强要求将关税存入这些外资银行，用于支付战争赔款，中国相继失去了关税的保管权和支配权。而《辛丑条约》签订之后，为保证清政府能够足额支付巨额赔款，西方国家将距海关50里以内的常关也纳入外籍税务司制度进行征收管理，国外势力不但完全控制了中国海关，连常关关税的征收、保管和支配也开始染指。

[5] Bai JW,Li YC,Zhang G，et al.Cell cycle regulation and anticancer drug discovery[J].Cancer Biol Med,2017,14:348.

本研究利用液相色谱-质谱联用仪分析了白酒中甜味剂三氯蔗糖化合物的分子信息，利用多反应监测模式的液相色谱-质谱联用仪技术，建立了一个快速、稳定、灵敏的可定性定量检测三氯蔗糖的方法。该方法可在10 min内完成，其检测范围内线性良好（r=0.99999），检出限0.04 mg/L，定量限0.1 mg/L，精密度＜2%，回收率＞85%，且与国标中的检测方法相比检出限更低，能更加有效的监测白酒中三氯蔗糖的含量，综上所述，该方法可以对三氯蔗糖进行实际的定性定量检测。

[6] Vijayaraghavan S,Moulder S,Keyomarsi K,et al.Inhibiting CDK in cancer therapy:current evidence and future directions[J].Target Oncol,2018,13:21.

研究料液循环流量对膜性能的影响，使其他条件不变(料液浓度：2 mol/L；料液温度：60 ℃；冷侧冷却温度：5 ℃)，改变料液和冷凝液的循环流量，配制NaCl溶液、MgCl2溶液和KCl溶液 500 mL，分别在 300,500,700和900 mL/min循环流量下进行实验，并记录数据。

[9] Muat M,Vax VV,Borboli N,et al.Cell cycle dysregulation in pituitary oncogenesis[J].Front Horm Res,2004,32:34.

2.2 p21Waf1/cip1和p27Kip1表达与各临床特征的关系 见表1、表2。p21Waf1/cip1和p27Kip1表达水平与患者的性别和年龄无关。按肿瘤大小分组(中位数4.35 cm3)，p21Waf1/cip1和p27Kip1表达水平与肿瘤体积有关，大肿瘤的表达水平低(χ2=7.191，P=0.007；χ2=5.149，P =0.023)。侵袭组的p21Waf1/cip1和p27Kip1表达水平低于非侵袭组，差异具有统计学意义(P=0.00， P=0.001)。所有94例患者均得到随访2～6年，平均3.5年；p21Waf1/cip1和p27Kip1表达水平与肿瘤复发与否无关(χ2=1.649，P=0.199；χ2=3.232，P=0.072)。p27Kip1表达水平与血清促乳素水平呈负相关(r=-0.237，P<0.01)。肿瘤切除程度与p21Waf1/cip1和p27Kip1表达水平无关。

[7] Thwaites MJ,Cecchini MJ,Passos DT,et al.Interchangeable roles for E2F transcriptional repression by the retinoblastoma protein and p27KIP1-Cyclin-Dependent kinase regulation in cell cycle control and tumor suppression[J].Mol Cell Biol,2017,37:e00561.

[10] Singh SK,Banerjee S,Acosta EP,et al.Resveratrol induces cell cycle arrest and apoptosis with docetaxel in prostate cancer cells via a p53/ p21WAF1/CIP1 and p27KIP1 pathway[J].Oncotarget,2017,8:17216.

[2] Su B,Chen X,Zhong C,et al.All-trans retinoic acid inhibits mesangial cell proliferation by up-regulating p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 and down-regulating Skp2[J].J Nephrol,2012,25:1031.

[12] Dong W,Li J,Liu Q,et al.P21Waf1/Cip1and p27kip1are correlated with the development and invasion of prolactinoma[J].J Neurooncol,2018,136:485.

[13] Cheng CW,Leong KW,Ng YM,et al.The peptidyl-prolyl isomerase PIN1 relieves cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) inhibition by the CDK inhibitor p27[J].J Biol Chem,2017,292:21431.

[14] Dobashi Y,Tsubochi H,Minegishi K,et al.Regulation of p27 by ubiquitin ligases and its pathological significance in human lung carcinomas[J].Hum Pathol,2017,66:67.

[15] Berton S,Cusan M,Segatto I,et al.Loss of p27kip1increases genomic instability and induces radio-resistance in luminal breast cancer cells[J].Sci Rep,2017,7:595.

[16] Brugarolas J,Chandrasekaran C,Gordon JI,et al.Radiation-induced cell cycle arrest compromised by p21 deficiency[J].Nature,1995,377:552.

1.1 一般资料 选取65例食管癌组织为研究组，同时取癌旁正常食管组织20例为对照组。研究组男44例，女21例；年龄43～80岁，平均(66.98±8.18)岁；病变位置：下段15例，中段38例，上段12例；病理类型：腺鳞癌8例，鳞癌57例；无淋巴结转移34例，区域淋巴结转移31例；临床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期24例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例。

[17] Berton S,Pellizzari I,Fabris L,et al.Genetic characterization of p27(kip1) and stathmin in controlling cell proliferation in vivo[J].Cell Cycle,2014,13:3100.

[18] Martins CS,Camargo RC,Saggioro FP,et al.P27/CDKN1B translational regulators in pituitary tumorigenesis[J].Horm Metab Res,2016,48:840.

限幅机构是一种安装在钻具轴向中间位置的定点解锁外部支撑装置[17]。如图3所示，限幅机构在钻取采样过程中的动作时序主要包括：1)飞行工作阶段钻杆限幅；2)浅层钻进阶段钻杆扶正导向；3)解锁触发；4)深层钻进阶段避让钻机；5)抵达预定钻进深度。

[19] Myers TK,Andreuzza SE,Franklin DS.p18INK4c and p27KIP1 are required for cell cycle arrest of differentiated myotubes[J].Exp Cell Res,2004,300:365.

[20] Werner RJ,Kelly AD,Issa JJ.Epigenetics and precision oncology[J].Cancer J,2017,23:262.

[21] Zhao Y,Li Q,Wu X,et al.Upregulation of p27kip1 by demethylation sensitizes cisplatin-resistant human ovarian cancer SKOV3 cells[J].Mol Med Rep,2016,14:1659.

而企业之间的合并也分多种，比如中国远洋和中国海运合并为中远海运集团，属于国企之间的合并重组，比如顺丰与夏辉合并为新夏辉，属于中外合资。

通过上述平台，一方面完成对高校图书馆学术信息资源的存储；另一方面完成对学术信息资源的挖掘。通过这种海量挖掘的方式，并结合各种挖掘算法，进而完成对高校图书馆学术资源的共享。