中枢神经系统(central nervous system，CNS)原发性肿瘤的发病率约为18.7/100 000，但是大约4/5的CNS恶性肿瘤是恶性胶质瘤。其具有侵袭性强，预后差的特点。目前临床上治疗胶质肿瘤主要采取手术切除为主,术后以放射治疗和化学治疗为主。同时术中手术切除病变范围也是影响胶质瘤患者总生存期的重要因素之一,所以最大范围安全切除肿瘤是目前国内外公认的手术原则[1]；但胶质瘤患者的总体预后仍不是很理想。曾剑平等报道，低级别胶质瘤患者的中位生存期为21.5个月，而高级别胶质瘤患者仅为17个月[2]。目前关于胶质瘤是由多种基因加之多步骤进展而形成的分子生物学机制已得到证实。因此，从神经胶质瘤的发病机制出发寻找一种新的治疗方法，一直是目前研究胶质瘤治疗的重点。近年来,更多的研究关注集中在miRNA在肿瘤细胞凋亡途径中的作用。之前本课题组的研究发现，miR-137在胶质瘤组织中的表达与正常人脑组织相比，是低表达量水平，对胶质瘤细胞的生长起抑制用，提示miR-137与胶质瘤的产生有很大的相关性[3]。但是miR-137具体是否对胶质瘤细胞侵袭及其相关机制有影响，目前仍不明确。因而本研究用miR-137转染人脑胶质瘤细胞株LN299细胞,研究miR-137在胶质瘤细胞整个侵袭过程中的具体作用；并进一步探讨其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞株LN229(中科院上海细胞库)；转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；qRT-PCR试剂、PCR引物、miR-137寡聚核苷酸(miR-137 mimics，购自上海吉玛制药技术有限公司);MTT试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)；Transwel侵袭小室(美国Costar公司)；Matrigel(BD PharMingen公司)；超敏发光液(普利莱公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore 公司)；T细胞因子-4(TCF-4)一抗(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

压缩特性参数相关性分析如表2所示。从表2中可以看出，破坏极限与屈服极限、破坏能存在一定的相关性，同时屈服极限又与变形能存在一定的相关性。其中破坏极限与屈服极限相关性最高为0.927，屈服极限与变形能的相关性次之为0.926，破坏极限与破坏能相关性最低为0.894。

1.2.1 miR-137 mimics设计合成 从miRNAs数据库获得miR-137基因序列。miR-137 mimics序列：5’- UUA UUG CUU AAG AAU ACG CGU AG-3’,5’-ACG CGU AUU CUU AAG CAA UAA UU-3’；无义序列：5’- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’,5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。

1.2.2 细胞培养与转染 将LN299细胞(1×106/mL)置于12孔培养板中,条件设置为37℃ 和5%CO2在DMEM完全培养液中常规培养24 h，处理后孵育15 min后，加入到孔板中，6 h后换液，继续培养24 h后同样条件下重复转染一次，继续培养24 h。细胞分为3组：空白组，阴性对照组(转染无义序列)，转染miR-137 mimics序列组(miR-137 mimics组)。

在怠速时，读取发动机控制单元中凸轮轴数据流，发现进气和排气凸轮轴位置执行器电磁阀位置在0～50%之间不停跳动，正常值应稳定在45%左右。进气凸轮轴位置实际值与期望值相差16°。通过分析数据流，我们认为可能的故障原因主要有以下几点：

1.2.3 各组细胞miR-137表达水平检测 采用实时定量PCR(qRT-PCR)法。将经过48 h转染后的LN229细胞经PBS洗后收集细胞，为了充分裂解细胞须加入1 mL Trizo，进行不断的吹打，之后静置5 min后加入0.2 mL氯仿，混匀后室温静置3 min。在4℃条件下离心机(12 000 rmp)高速离心15 min，加入0.5 mL异丙醇，混匀后置于-80℃的条件下2 h。离心机高速(12 000 rmp)离心10 min，弃上清，加入50 μL DEPC处理水溶液沉淀。以miR-137特异逆转录引物，M-MLV逆转录酶逆转录合成cDNA。qRT-PCR检测反应条件为，95℃ 10 min，95℃ 15 s及60℃ 1 min，共40个循环。基因相对表达量采用2 -ΔΔCt进行计算分析。

电力体制改革方面也是硕果累累。省级电网实现输配电价改革全覆盖;跨区跨省可再生能源电力现货交易试点深入推进;售电侧市场竞争机制逐步建立，分3批推出320个增量配电业务试点项目。上半年，全国电力市场交易电量累计8 024亿千瓦时，同比增长24.6%。

1.2.4 细胞生长状况测定 采用MTT实验法。各组处理后的LN229细胞消化后加入培养基形成培养液中，100 μL/孔(2×104)接种于96孔培养板中，在条件为37℃和5%CO2下进行培养。等待48 h后每孔加入5 μL的MTT溶液培养，到达检测点时弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解蓝紫色结晶，轻轻振动10 min后，用酶标仪(波长为550 nm)测定各孔的吸光度值，取5个孔的平均值。

[1] 漆松涛，李志勇，方陆雄，等．功能区胶质瘤手术的基本策略与方法[J]．中华神经外科杂志，2013，29：1083．

1.2.6 各组细胞中TCF-4蛋白表达水平检测 采用Western Blot法。提取各组细胞总蛋白，BCA法进行定量分析，每个上样孔加入40 μg总蛋白。8 V/mL电压电泳至染料进入分离胶，将电压调整至15 V/mL，当染料到达分离胶底部后结束电泳。湿转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉于37℃下封闭1 h，室温一抗(1∶500)1 h(水平摇床)，PBS漂洗3次，每次5 min；室温二抗(1∶1 000)1 h(水平摇床)，PBS漂洗3次。用Pierce ECL发光液加于PVDF膜上，暗室中孵育约5 min，即可见发光的杂交带，凝胶成像仪成像。内参照以GAPDH检测结果为准。将空白组、阴性对照组及miR-137 mimics组的电泳条带用QuantityOne Basic软件分析其灰度值，不同处理组的灰度值均除以空白组，获得各组的相对灰度值，表示TCF-4蛋白的表达水平。

TCF家族有许多成员，而TCF-4作为其家族中的一员，开始作为淋巴转录因子在克隆过程中被发现。通常在组织发育和分化过程中，TCF-4不仅仅对细胞增殖、分化起到促进作用，而且对细胞过度生长也起到一个抑制作用；从而防止肿瘤的发生。而胚胎期，TCF-4主要介导对肠管的发育。TCF-4参与的Wnt信号转导通路是调控细胞侵袭的重要途径,是侵袭信号通路中的关键信号分子。有研究显示，在级别越高的胶质瘤组织中TCF-4蛋白表达水平也越高；因此其表达水平与胶质瘤病理级别存在一个正相关关系；敲低TCF-4可以抑制胶质细胞增殖和侵袭能力，提示TCF-4为胶质瘤致癌基因，在胶质瘤侵袭进程中起到重要作用[20]。本研究通过Western blot法检测miR-137 mimics转染后各组LN229细胞中的TCF-4蛋白表达水平，结果显示miR-137 mimics 组细胞中的TCF-4蛋白表达水平明显低于空白组和阴性对照组(均P<0.05)。表明上调miR-137能明显抑制LN229胶质瘤细胞的TCF-4蛋白表达水平，提示miR-137可能进一步通过下调TCF-4表达来抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。

2 结 果

2.1 miR-137 mimics组、空白组及阴性对照组LN229细胞的miR-137表达水平 3组LN229细胞的miR-137相对表达水平分别为：空白组31.22±2.98，阴性对照组29.16±3.05，miR-137 mimics组71.15±5.38。miR-137 mimics组LN229细胞的miR-137相对表达水平明显高于空白组和阴性对照组(均P<0.05)。

2.2 3组LN229细胞的增殖能力比较 MTT实验显示，3组LN229细胞的相对存活率分别为：空白组(23.43±2.87)%，阴性对照组(25.84±2.61)%，miR-137 mimics组(11.45±1.24)%。miR-137 mimics组细胞的相对存活率明显低于空白组和阴性对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。提示miR-137 mimics对LN229胶质瘤细胞的增殖能力起到明显的抑制的作用。

2.3 3组LN229细胞的侵袭能力比较 Transwell实验显示，miR-137 mimics组穿过人工基底膜的细胞数为(16.9±2.1)个，空白组及阴性对照组分别为(44.4±6.8)个和(42.2±6.1)个。空白组与阴性对照组穿过基底膜的细胞数比较，差异无统计学意义；而miR-137 mimics组穿过基底膜的细胞数则较空白组和阴性对照组明显减少，差异均有统计学意义(均P<0.05)(图1)。表明miR-137 mimics可以抑制LN229细胞的侵袭和迁移能力。

  

图1 Transwell实验显示3组穿过基底膜的细胞数；miR-137 mimics组穿过基底膜的细胞数明显少于空白组和阴性对照组(苏木精染色，250×)

2.4 3组LN229细胞的TCF-4蛋白表达水平比较 见图2。与空白组及阴性对照组相比，miR-137 mimics组细胞的TCF-4蛋白表达水平明显降低(均P<0.05)；显示miR-137 mimics 能够明显降低LN229胶质瘤细胞中的TCF-4蛋白表达水平。

  

图2 Western blot法检测3组细胞的TCF-4蛋白表达水平；miR-137 mimics组电泳条带的灰度值显著低于空白组及阴性对照组

3 讨 论

胶质瘤因为其细胞的侵袭性生长特点，肿瘤与正常脑组织之间的边界不是很清楚，手术往往需要沿着可见的肿瘤边缘扩大切除。但即使如此，胶质瘤患者术后的生存周期仍较短；因此胶质瘤最显著的特征是侵袭能力强。目前对于胶质瘤的治疗，尤其是显微外科的广泛应用，加之术中磁共振及神经导航等设备的临床应用，在一定程度上改善脑胶质瘤手术治疗的效果，延长了患者的生存期；但是术后胶质瘤的高复发率仍较为常见。因此对胶质瘤基因的研究势在必行，通过近年来对miRNA不断研究认识，发现miRNA在胶质瘤生长侵袭过程往往起到一个主导调控的作用[4]。付旭东等报道miR-34b在胶质瘤组织中呈低表达，对miR-34b表达水平进行上调后发现，其对胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力起到抑制作用[5]。有研究表明，miRNA-451通过调控相关靶基因及下游信号通路，抑制人脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力[6]。miR-16、miR-218等微小RNAs同样分别通过下游相关基因调控胶质瘤细胞的侵袭能力[7-8]。本课题组的前期研究发现，通过转染miR-21反义寡聚核苷酸能对胶质瘤细胞的生长起到明显的抑制作用,并可使细胞在G1/G0期停滞，加速细胞走向凋亡；通过一系列调控hTERT表达，最终对胶质瘤细胞的生长起到抑制作用[9]。

[3] 郭俊，李民，万政强，等．MiR-137对人脑胶质瘤细胞株U87细胞增殖和凋亡影响的体外研究[J]．中华神经医学杂志，2013，12：1216．

miR-137在肿瘤中的调节作用主要通过其CpG岛甲基化完成。本课题组的前期研究发现，在多个胶质瘤细胞株中miR-137的表达水平明显低于正常脑组织。在U87胶质瘤细胞中如果上调miR-137的表达水平，能够显著抑制U87细胞增殖水平，并诱导细胞凋亡。进一步研究发现，与正常脑组织的miR-137表达水平相比，miR-137在人脑胶质瘤组织中的表达水平明显呈低表达，并与胶质瘤级别呈负相关；miR-137通过靶向Rac1基因抑制胶质瘤细胞生长[17]。Li等研究发现，miR-137在少突胶质细胞瘤组织中的表达量是较低的，过表达miR-137可以对少突胶质细胞瘤细胞的增殖和侵袭能力起到抑制的作用[18]。miR-137在小儿高级别胶质瘤中同样呈低表达，在儿童高级别胶质瘤细胞的生长过程中过表达miR-137通常起到抑制作用。miR-137可以通过EZH2抑制胶质瘤细胞的生长和血管生成[19]。本研究通过对LN229胶质瘤细胞转染miR-137 mimics，进一步分析miR-137在肿瘤细胞增殖过程中，以及对其侵袭能力的影响作用。结果表明，过表达miR-137 mimics对LN229细胞的增殖起到明显的抑制作用，从而显著降低其侵袭能力。

式中，Magg和Sagg分别表示制造业和生产性服务业的区位熵，Coagg越大，表示制造业与生产性服务业二者之间协同集聚水平越高。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5软件进行统计学处理分析。所有实验均在同样条件下独立重复3次。检测数据以均数±标准差表示，P<0.05表示差异有统计学意义。

[8] 张金灿，胡丹，贺礼进，等．干扰miR-21表达抑制胶质瘤U251细胞增殖迁移与侵袭[J]．中南医学科学杂志，2016，44：143．

综上所述，miR-137可能通过下调TCF-4表达抑制胶质瘤细胞的侵袭能力；其在胶质瘤细胞的增殖、生长周期及凋亡的过程中起到一个对癌基因抑制的作用。研究miR-137对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响，从而对认识胶质瘤侵袭进程有重要的作用，对胶质瘤的分子生物学机制有了更多的认识；并且miR-137可作为临床检测胶质瘤的一个分子标记，最终为胶质瘤基因治疗提供有效的目标靶点。

中国养猪业正处于重大变革时期，在经营主体、经营方式、区域布局、生产工艺、疫病防控、产品安全、环境控制等方面，都在发生着深刻的变革。同时面临着由农户养猪向集约化和产业化转型的剧烈市场动荡期。作为我国农业主要产业部门和居民肉食品主要来源的养猪业，正在走向健康平稳发展的轨道。

为有效对接调整粮食统计口径带来的政策制度方面的变化和解决可能出现的问题和矛盾，建议在合理调整粮食统计口径过程中辅以相关的配套政策和措施。

[参 考 文 献]

1.2.5 细胞侵袭性测定 采用Transwell实验。首先预冷无血清DMEM培养基稀释的Matrigel基质胶(matrigel:DMEM=1:2)，之后使用于在Transwell上室的聚碳酸酯滤膜的培养小室上铺。将各组处理后的LN229细胞消化成单细胞悬液，在Transwell上室孔中准确加入100 μL细胞(2×104个/mL)；条件设置为37℃及5%CO2条件下培养24 h；每组设3个平行实验。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗涤2次，用湿棉签轻轻擦掉膜上层未穿过膜的细胞，苏木精染色，冲洗干净后Clearmont对侧封片，80℃烤干。倒置显微镜下(250倍)观察穿过细胞膜的细胞数。随机计数16个视野的细胞数，取平均数为每组穿过小室细胞数。

[2] 曾剑平，刘青，林志雄，等．脑胶质瘤患者预后相关影响因素分析[J]．临床神经外科杂志，2015，12：410．

miR-137位于染色体1p22区域，近年来多项研究发现miR-137在各种肿瘤组织的表达通常较低，在肿瘤细胞增殖、生长周期及凋亡的过程中起到一个抑癌基因的作用[10-13]。Du等研究发现，在胃癌细胞中miR-137呈低表达,一旦出现miR-137过表达，其在胃癌细胞增殖过程中往往起到明显的抑制作用,并阻滞细胞周期G0/G1期生长的作用[14]。与正常人肺细胞和癌旁组织相比,miR-137在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达水平明显呈现低表达；而一旦miR-137出现过表达，则对非小细胞肺癌细胞的生长起到抑制作用；而沉默miR-137后提高非小细胞肺癌细胞的增殖能力；提示miR-137在非小细胞肺癌的生长发展进程中起重要作用[15]。miR-137同样正是由于在结肠癌组织中表达量相对较低,所以可以作为结肠癌生物标记，预测肿瘤进展；过表达miR-137在结肠癌细胞增殖和肿瘤形成的过程中同样起到抑制作用,并起到诱导结肠癌细胞凋亡,对细胞周期可在G2/M期起到阻滞作用16]。

文章主要针对造林技术设计进行了一些分析，简要概述了设计的原则以及具体的技术设计方法等，同时，研究和探讨了项目的投资估算以及效益评价的方法和流程，希望可以为有关的单位及人员的研究提供一些参考和帮助。

[4] Barciszewska AM.MicroRNAs as efficient biomarkers in high-grade gliomas[J].Folia Neuropathologica,2016,54:369.

⑮胡威:《我国地方政府人才政策创新动因研究——基于北京、上海和浙江的分析》，《行政论坛》2018年第1期。

[7] 杨天权，吴庭枫，李炎炎，等．miR-16通过调控NF-ΚB1/MMP-9信号通路抑制胶质瘤侵袭的实验研究[J]．中华神经医学杂志，2014，13：1081．

[6] 郭红宝，南阳，甄英伟，等．微小RNA-451对LN229胶质瘤细胞系侵袭和迁移的影响[J]．中华神经医学杂志，2016，15：548．

[5] 付旭东，张艳艳，周少龙，等．微小RNA-34b在胶质瘤组织的表达及其对人胶质瘤细胞株A172增殖,凋亡和侵袭力的影响[J]．中华实验外科杂志，2016，33：2709．

利用电脑绘画的可重复性、可修改性、可选择性特点，可以突出美术教学中的重点、难点，反复演示，化繁为简，化难为易，帮助学生加深记忆和理解，掌握技能。以往为了讲清楚一个重点难点，教师往往花费时间和精力制作一个课精美的课件。课件虽然具有使用方便的特点，但它费时费力，而且使用起来不够灵活。其实有的利用绘画软件就可以很容易地演示清楚。

[9] 李民，李东儒，孙关，等．反义miR-21通过调控hTERT表达抑制胶质瘤细胞生长[J]．临床神经外科杂志，2013，10：277．

[10] 刘晓阳，郑海伦，任志，等．microRNA-137对人胃癌MKN-45细胞迁移侵袭的影响[J]．安徽医科大学学报，2015，50：1748．

[11] 陈俊杰，郑娜芬，林俊汕，等．miR-137抑制人葡萄膜黑素瘤细胞的增殖和迁移[J]．医药前沿，2014，20：18．

老佛爷这回是真怒了，但是却来不及找程廷华的麻烦了，抢班夺权已经到了白热化阶段，先处理了康有为、梁启超，接着在菜市场斩了六君子，继而北方又闹起了义和团，八国联军跟着来了，清廷急急忙忙去了西安“打猎”，宫宝田一路护送。而程廷华，则和他的义兄李存义还有大批武林高手们联合起来，跟洋人们对着干，在砍杀了数名德国兵后，跳上屋顶逃跑时，辫子被屋檐挂住，倒在了排枪之下。

[12] 王榕，夏锡伟，王穗暖，等．miR-137在胶质瘤中的表达及其临床意义[J]．中华实验外科杂志，2012，29：2091．

[13] 喻超，肖杰，江建新，等．MicroRNA-137在胰腺癌中的表达及临床意义[J]．贵阳医学院学报，2015，40：117．

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[20] Zhang J,Huang K,Shi Z,et al.High β-catenin/Tcf-4 activity confers glioma progression via direct regulation of AKT2 gene expression[J].Neuro Oncol,2011,13:600.

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