脑胶质瘤是人脑中最常见的原发性肿瘤，呈弥漫性浸润生长，至今仍是预后最差的肿瘤之一。其中，多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)即使采用手术及放化疗等综合治疗手段，患者的5年生存率仍然低于5%[1]。胶质瘤在本质上属于一种多基因病变，其发生发展受多种基因及相关信号通路的调控。信号转导和转录激活因子3(STAT3)是肿瘤中多种调控基因及相关信号通路之间的关键节点[2]，胶质瘤中异常活化的STAT3与肿瘤细胞的干性维持、放化疗抵抗和侵袭等密切相关[3-6]。因此，明确胶质瘤中STAT3异常活化机制对脑胶质瘤的治疗，尤其是靶向治疗具有重要意义。Smad蛋白家族中的抑制型成员包括Smad 6和Smad 7。Smad 6主要表达于细胞核并且参与了多种信号通路及核蛋白间的相互作用[7-9]，因此Smad 6在肿瘤中的作用也日益受到关注。本研究检测胶质瘤细胞核中Smad 6的表达水平，观察其对胶质瘤细胞增殖的影响，以及对STAT3的调控作用；旨在探讨人脑胶质瘤细胞中Smad 6的功能及调控STAT3异常活化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

60例患者中行单纯手术治疗的患者为57例,手术辅助其他治疗方式所有患者均采用气管内插管全身麻醉,手术中行气管切开1例,术后气管切开患者1例。60例甲状腺患者行腺叶切除术,其中行单侧腺叶+峡部切除术的患者为35例,行单侧腺叶+峡部+对侧部分切除患者13例,行联合根治术的患者为10例,行单侧腺叶+峡部切除+分期颈淋巴结清扫术2例,手术中无死亡病例。

对照组病患吞咽不适例数与观察组相比,P大于0.05,无明显差异;对照组病患的切口黏连例数与观察组相比,P大于0.05,无明显差异;对照组病患的伤口疼痛例数与观察组相比,P大于0.05,无明显差异;但是对照组总并发症发生率比观察组高,P小于0.05,差异具有统计学意义。具体如下表所示。

1.1.1 细胞及动物 293T细胞 (本院临床研究中心)，原代胶质瘤细胞株(Ⅳ级胶质瘤患者手术切除的肿瘤组织培养构建，选取4株);4周龄雄性裸鼠(常州市卡文斯实验动物有限公司)。

1.1.2 主要试剂和抗体 DMEM、胎牛血清和EdU细胞增殖检测试剂盒(Invitrogen公司)；细胞培养板和培养皿(Corning公司)；Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；ECL发光液(PIERCE公司)；Smad 6和PCNA(细胞核内参)单克隆抗体(Abcam)；Cell Counting Kit-8(CCK8)检测试剂盒(Bimake公司)；基质胶(BD)；萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将细胞接种于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM中，放入37℃、含5%CO2的培养箱中培养；待细胞培养到3～4 d，处于对数生长期时，即可传代或用于实验。

[3] Furtek SL,Backos DS,Matheson CJ,et al.Strategies and approaches of targeting STAT3 for cancer treatment[J].ACS Chem Biol,2016,11:308.

1.2.3 CCK8检测 取生长良好的肿瘤细胞，按每孔2 000个细胞的密度接种于96孔板，每组设立2个副孔，分为4个时间点(4 h，24 h，48 h，72 h)进行检测。检测时按CCK8试剂盒说明书每孔加入10 μL CCK8试剂，细胞培养箱内孵育2 h后测定450 nm处的吸光度；以各组细胞培养4 h的吸光度为1，绘制细胞生长曲线。

电气自动化系统的导入主要通过在计算机中输入相关数据和参数的方式来实现，在现代移动互联技术发展支持下，能够高效记录甚至无线传递电气工程中的大数据，以人性化、智能化方式对数据进行分析，消除运行隐患，如采用专家系统提示，遗传机理搜索归纳，多层人工神经网络预测、模糊理论的物理学方法等智能算法，实现系统控制的快速响应、精准处理与及时干预。在系统的优化控制中，可有效缩小电气系统在运行过程中的时间和误差，提高系统的运行效率，使其更加科学化、合理化、精确化。由此可见，改善电气系统内部环境是完善电气工程自动化系统发展的重要举措，相关人士应当致力于系统的研究，为电气工程的发展提供良好的数据支持。

1.2.5 EdU掺入增殖实验 将已构建的4种稳转细胞以适宜的细胞数接种于细胞爬片上，待细胞生长至60%～70%融合度时进行实验。准备2×EdU溶液，预热后替换一半培养基，使之成为1×EdU溶液，室温孵育后用4%的多聚甲醛固定15 min；使用含3%BSA(牛血清白蛋白)的PBS洗涤之后，用含0.5% Triton X-100的破膜剂孵育20 min，吸去破膜剂后用3%的BSA洗涤，然后加入配好的cocktail染色液室温避光孵育30 min，含3%BSA的PBS洗涤之后再加入配好的细胞核染色液避光孵育30 min，PBS冲洗之后即可封片观察。

高中数学高效解题，即在短时间内完成大量的数学题，并保持较高的准确率。要想在数学考试中取得较好的成绩，做题速度和准确度缺一不可。而在速度和准确率都有基本保证的情况下，如何让自己在简单题上花费更少的时间，并在难题上取得更多的分值，便成为了我们学生必须面对的问题。

㉛姜迎雪:《国家审计制约公共经济权力的功能和实现路径初探——基于公众参与治理的视角》，《审计月刊》2016年第4期。

1.2.6 肿瘤细胞成球实验 以神经干细胞培养液(D/F12培养液+20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF+N2)培养已构建的稳转细胞，使之诱导为干细胞球(肿瘤干细胞样细胞)；比较形成的肿瘤干细胞球的大小。

1.2.7 裸鼠皮下荷瘤模型 将生长良好的4种稳转细胞接种于10 cm的培养皿中，待细胞融合度达到90%时收集细胞，调节细胞浓度为1×107个/mL左右。将4周龄的雄性裸鼠异氟烷吸入麻醉，待麻醉完全后，用1 mL胰岛素注射器吸取细胞悬液125 μL，缓慢注射到裸鼠右侧腋部皮下；注射后缓慢退针，防止细胞悬液外溢。

1.2.8 荧光素酶报告基因检测 STAT3报告基因质粒pGL4.47(Luc2P/SIE/Hygro)含有5个拷贝的驱动荧光素酶报告基因luc2P表达的SIE(sis诱导因子)，将质粒转染293T细胞。在整个实验过程中，使用pRL-TKRenilla荧光素酶质粒在每个孔中维持恒定的转染DNA总量。转染后36 h，根据需要用IL-6刺激细胞6 h，然后收获细胞，通过双荧光素酶报告分析系统测定荧光素酶的活性。

1.3 统计学方法 使用SPSS 18.0软件进行统计分析处理，Graphpad 6.01进行数据绘图。检测结果的计量数据以均数±标准差表示，两组均数间比较采用t检验。细胞核Smad 6蛋白表达水平与原代胶质瘤细胞增殖能力之间的相关性，采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.4 细胞感染和稳转细胞株的筛选 取对数生长期的4种原代胶质瘤细胞，以适宜的细胞数接种于6孔板，待细胞生长至60%～70%融合度时进行病毒感染，转染前更换新鲜培养液。将本实验室已构建的慢病毒Lenti-Smad 6-NLS(带3×Flag)和Lenti-Con-NLS感染原代胶质瘤细胞核中Smad 6表达最低者，Lenti-shSmad 6和Lenti-shNC1感染原代胶质瘤细胞核中Smad 6表达最高者，24 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。48 h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达量，并加入嘌呤霉素(2 μg/mL)进行筛选，连续筛选1周后(中间间断性更换培养液)，观察剩余细胞的荧光表达量，细胞感染率达到90%以上时，即将嘌呤霉素浓度降为1 μg/mL，维持此浓度继续培养细胞1周后扩增并冻存。

2 结 果

2.1 胶质瘤细胞核的Smad 6蛋白表达和增殖能力及其相关性 原代胶质瘤细胞核中均有不等量的Smad 6表达，PCNA为细胞核蛋白内参照物(图1A)。CCK8细胞增殖实验检测这4株患者来源的胶质瘤细胞的增殖能力，并绘制细胞生长曲线(图1B)。以接种4 h各细胞的吸光度为1，GBM-1细胞24 h、48 h和72 h的相对增殖率分别为(1.20±0.03)、(1.68±0.09)、(2.29±0.15)，GBM-2分别为(1.27±0.05)、(1.85±0.09)、(2.76±0.18)，GBM-3分别为(1.43±0.05)、(2.20±0.15)、(4.10±0.27)，GBM-4分别为(1.32±0.06)、(2.02±0.10)、(3.39±0.26)；4组细胞间的细胞增殖能力比较，差异均有统计学意义(P<0.05～0.001)。Smad 6蛋白表达水平与细胞增殖能力的相关性分析显示，Smad 6表达水平与细胞的增殖能力呈正相关(r=0.968,P<0.05)(图1C)。

  

A：原代胶质瘤细胞核中Smad 6的表达水平，PCNA为细胞核内参；B：原代胶质瘤细胞的生长曲线(注：与GBM-1相比a P<0.05，b P<0.01，c P<0.001；与GBM-2相比d P<0.05，e P<0.01；与GBM-3相比f P<0.05)；C：Smad 6蛋白表达水平与原代胶质瘤细胞增殖能力的相关分析图1 各组胶质瘤细胞核中Smad 6表达水平与增殖能力及其相关性

2.2 Smad 6细胞核稳定过表达(Smad 6-NLS)和敲减(Smad 6-KD)细胞株的建立及鉴定 挑选Smad 6低表达的胶质瘤细胞构建Smad 6稳定过表达细胞株，而将Smad 6高表达胶质瘤细胞构建Smad 6稳定敲减细胞株。在荧光显微镜下观察,4组细胞均显示绿色荧光蛋白(GFP)的表达(图2A)。Western blot检测结果显示,Smad 6-NLS相比较于其阴性对照(Vector)，Smad 6蛋白表达水平显著增高；Smad 6-KD相比较于其阴性对照(NC)，Smad 6蛋白表达水平显著降低(图2B)；表明细胞核Smad 6过表达和敲减的胶质瘤细胞株构建成功。

2.3 Smad 6对体外胶质瘤细胞增殖能力的调控 CCK8细胞增殖实验检测各组细胞的生长能力，并绘制细胞生长曲线(图3A)。以接种4 h各细胞组的吸光度为1，Smad 6-NLS组24 h、48 h和72h的相对增殖率分别为(1.57±0.03)、(2.61±0.23)、(4.35±0.27)；Vector组分别为(1.30±0.05)、(1.73±0.06)、(2.52±0.16)；Smad 6-KD组分别为(1.18±0.04)、(1.57±0.05)、(2.24±0.11)；NC组分别为(1.41±0.04)、(2.07±0.14)、(3.88±0.25)。EdU掺入增殖实验显示细胞核Smad 6对细胞生长能力的影响(图3B)。Smad 6-NLS、Vector、Smad 6-KD和NC组的增殖细胞比例分别为(59.60±7.09)%、(37.80±5.07)%、(20.6±2.88)%、(42.2±5.54)%。肿瘤细胞悬浮成球实验显示干细胞样细胞的自我更新能力(图3C)。培养7 d后Smad 6-NLS、Vector、Smad 6-KD和NC组的干细胞球平均球径分别为(98.10±24.61)、(76.30±19.61)、(51.52±14.70)、(80.42±23.04)。以上结果表明，胶质瘤细胞核中过表达Smad 6可以促进其在体外增殖，而抑制Smad 6表达则会干扰胶质瘤细胞在体外增殖，差异具有统计学意义(均P<0.001)。

  

A：荧光显微镜下显示，4组细胞均有GFP蛋白表达(×200);B：Western blot法检测Smad 6细胞核稳定过表达和敲减细胞的Smad 6表达水平图2 Smad 6细胞核稳定过表达和敲减的胶质瘤细胞株的鉴定

2.4 细胞核Smad 6参与体内胶质瘤细胞增殖能力的调控 裸鼠腋部皮下注射各组稳转细胞悬液7 d后，皮下长出平均25 mm3大小的肿瘤，通过每7 d测量1次肿瘤长短径来监测肿瘤生长，并绘制生长曲线。移植28 d后，将小鼠处死，收集肿瘤，称重并分析。生长曲线(图4A)显示，Smad 6-NLS组7 d、14 d、21 d和28 d所形成的肿瘤体积分别为(25.28±2.61)mm3、(61.04±6.62)mm3、(160.63±13.40)mm3、(304.24±17.07)mm3；Vector组分别为(24.97±3.54)mm3、(41.79±6.16)mm3、(71.48±5.67)mm3、(134.74±11.66)mm3；Smad 6-KD组7 d、14 d、21 d和28 d细胞所形成的肿瘤体积分别为(24.44±3.85)mm3、(32.08±2.82)mm3、(51.14±4.83)mm3、(85.69±7.85)mm3；NC组分别为(25.00±3.01)mm3、(42.31±3.39)mm3、(84.56±10.68)mm3、(164.14±14.51)mm3。Smad 6-NLS、Vector、Smad 6 KD和NC组细胞所形成的肿瘤质量分别为(85.00±20.17)mg、(28.88±10.36)mg、(21.25±7.78)mg、(42.13±11.89)mg(图4B)。结果表明，胶质瘤细胞核中过表达Smad 6可以促进其在裸鼠体内增殖，而抑制Smad 6表达则会减低胶质瘤细胞在裸鼠体内的生长与增殖，差异均有统计学意义(P<0.01～0.001)。

  

A:各组胶质瘤细胞生长曲线;B:EdU掺入增殖实验检测各组胶质瘤细胞增殖能力(×100)；C:肿瘤细胞成球实验检测各组胶质瘤干细胞样细胞的自我更新能力(×40)图3 各组胶质瘤细胞的增殖能力及胶质瘤干细胞样细胞的自我更新能力(***P<0.001)

  

A:各组胶质瘤细胞在皮下形成的肿瘤体积变化曲线；B：生长28 d后的皮下肿瘤及质量比较图4 各组胶质瘤细胞在皮下形成的肿瘤的体积和质量比较(**P<0.01,***P<0.001)

2.5 细胞核Smad 6对胶质瘤细胞STAT3活性调控和靶基因表达的影响 荧光素酶报告基因检测显示，细胞核过表达Smad 6增强IL-6诱导的SIE活性(图5A)；细胞核Smad 6增强STAT3增殖和神经干细胞相关的靶基因表达(图5B)。

3 讨 论

生理情况下，STAT3通常以无活性的单体形式存在于细胞质中，在多种细胞因子和生长因子的诱导下通过磷酸化而激活。正常STAT3的激活是快速而短暂的，仅能维持数分钟到数小时，但在胶质瘤中STAT3呈异常的持续性激活，并且与胶质瘤的发生发展有极大的关系[10-12]。因此，抑制STAT3的异常持续激活对胶质瘤的治疗具有重要的意义。

阿里巴巴集团CEO张勇也在很多场合表示，以“文化娱乐”为代表的“快乐版块”是阿里巴巴集团未来重要的战略方向，以大文娱为主的数字电商和以天猫淘宝为主的实物电商以及新零售、本地生活服务电商一起，是阿里巴巴三大业务板块。

融合DPI设备应对移动通信网络的省集中核心网的信令面（S6aa、S1-MME、S110/S11,Gx/RRx、Radius、L2TP、Mw/MMg/Mj/ISC/GGm、Cx/Dx/SSh/Zh等接口）及用户面（S1-U、S5//8、S2a、Gnn/Gp等接口）所涉及的链路进行采集。如下图所示：

[5] Abou-Ghazal M,Yang DS,Qiao W,et al.The incidence,correlation with tumor-infiltrating inflammation,and prognosis of phosphorylated STAT3 expression in human gliomas[J].Clin Cancer Res,2008,14:8228.

  

A：Smad 6-NLS过表达促进IL-6诱导的STAT3激活;B：细胞核Smad 6调控STAT3靶基因的表达水平图5 细胞核Smad 6促进STAT3转录调控活性和靶基因表达的荧光素酶报告基因和Western blot检测(***P<0.001)

另外，值得关注的是，Smad 6的促瘤作用并不仅限于STAT3，其还对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Wnt/β-catenin和GR等多种信号通路具有调控作用[8-9,14-15]，这充分表明了Smad 6作为一种促瘤因子对癌症的治疗具有非常重要的意义，值得继续研究、探索。

综上所述，本研究的结果表明了Smad 6是胶质瘤的一个重要的促癌蛋白，其促癌机制与促进STAT3的转录调控活性有关；这也为脑胶质瘤的靶向治疗提供了新的靶点和实验依据。

[参 考 文 献]

溧阳南山水库片区乡村旅游公路属于县域旅游公路,包括平横线、金溪路、金牛路、黄南线、X305、G233等公路组成,公路长度共计35 km(图2)。全线途经平桥、松岭、黄岗岭等多个村落。同时也串联起平桥石坝、青峰山庄、横涧幽兰园艺场等多个主要景点。沿线旅游资源类型丰富、价值较高,总体布局完善、功能明确,沿线可视景观优美、形式乡土自然,重要区域和景点配置服务设施完善。

[1] Binder DC,Davis AA,Wainwright DA.Immunotherapy for cancer in the central nervous system:Current and future directions[J].Oncoimmunology,2016,5:e1082027.

[2] Yu H,Jove R.The stats of cancer-New molecular targets come of age[J].Nat Rev Cancer,2004,4:97.

1.2.2 Smad 6蛋白表达检测 采用Western blot法。取胶质瘤细胞以适宜的细胞数接种于3.5 cm的培养皿中，待细胞生长至90%融合度时收集细胞，1×107细胞中加入1 mL Nc Buffer A，混匀冰上孵育20 min后加入55 μL Nc Buffer B，混匀冰上孵育1 min后，4℃ 12 000转离心15 min，吸去上清后在沉淀中加入500 μL Nc Buffer C，混匀后冰上孵育40 min，每隔10 min涡旋混匀1次。4℃，12 000 r/min离心15 min，收集上清至新的离心管中，-20℃保存(此提取液为细胞核蛋白)。BCA法测定蛋白含量，蛋白变性后按每孔20 μL上样，经10%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉-TBST封闭1 h，加Smad 6一抗孵育过夜；次日TBST洗3次，每次10 min，加入二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗3次；化学发光法(ECL)检测蛋白印迹。

[7] Hu CY,Mohtat D,Yu Y,et al.Kidney cancer is characterized by aberrant methylation of tissue-specific enhancers that are prognostic for overall survival[J].Clin Cancer Res,2014,20:4349.

[4] Kim E,Kim M,Woo DH,et al.Phosphorylation of EZH2 activates STAT3 signaling via STAT3 methylation and promotes tumorigenicity of glioblastoma stem-like cells[J].Cancer Cell,2013,23:839.

在细胞核中，Smad 6主要通过与蛋白结合的方式影响其他蛋白的稳定性和功能；特别是与多种转录因子相互作用并调节其活性[13]。本研究发现，细胞核Smad 6可以通过增强STAT3的转录调控活性和靶基因的表达，从而提高胶质瘤细胞的增殖能力。本研究结果提示，Smad 6可能是促进胶质瘤中STAT3异常活化的关键蛋白，但具体机制尚未得到明确。本研究揭示的促STAT3活化机制，即是Smad 6的作用机制之一，对于阐明STAT3在胶质瘤中异常活化的机制具有重要意义。推测Smad 6或与STAT3有直接的相互作用，或者通过影响与STAT3有直接相互作用蛋白的稳定性、调控方式、作用方式的形式来发挥作用。

[6] Kohsaka S,Wang L,Yachi K,et al.STAT3 inhibition overcomes temozolomide resistance in glioblastoma by downregulating MGMT expression[J].Mol Cancer Ther,2012,11:1289.

气体绝缘封闭式组合电器(gas insulated switchgear,GIS)因结构紧凑、占地面积小、可靠性高、检修维护工作量少等优点，被广泛应用于中国电力系统[1]。断路器因具有灭弧功能，能够关合、开断正常负荷电流及故障大电流，是保证GIS安全正常运行的关键设备。断路器操作机构作为断路器核心部件之一，是保证断路器正常开断、分合运行及故障电流的关键。该部件的可靠动作是保证断路器正常运行，保证电网设备安全、供电可靠的重要基础[2]。

[8] Ding ZY,Liang HF,Jin GN,et al.Smad 6 suppresses the growth and self-renewal of hepatic progenitor cells[J].J Cell Physiol,2014,229:651.

[9] Jung SM,Lee JH,Park J,et al.Smad 6 inhibits non-canonical TGF-β1 signalling by recruiting the deubiquitinase A20 to TRAF6[J].Nat Commun,2013,4:2562.

[10] Gong AH,Wei P,Zhang S,et al.FoxM1 drives a Feed-Forward STAT3-Activation signaling loop that promotes the Self-Renewal and tumorigenicity of glioblastoma stem-like cells[J].Cancer Res,2015,75:2337.

[11] Wake MS,Watson CJ.STAT3 the oncogene-still eluding therapy?[J].FEBS J,2015,282:2600.

[12] Kim HS,Li A,Ahn S,et al.Inositol polyphosphate-5-Phosphatase F (INPP5F) inhibits STAT3 activity and suppresses gliomas tumorigenicity[J].Sci Rep,2014,4:7330.

功率参数设计方案 用大信号频带完全覆盖机密信号频带，同时设计大信号和机密信号的功率参数满足Ps/Pw≥η0，η0表示能够保证机密信号抗盲检测的最小功率比值.

[13] Chen YL,Liu B,Zhou ZN,et al.Smad 6 inhibits the transcriptional activity of Tbx6 by mediating its degradation[J].J Biol Chem,2009,284:23481.

第一，纠错问题。认真的孩子作业按时完成，有自己做出的对错标记，有纠错。纠错是作业问题自我反思调节的一个过程。只有通过纠错才能真正了解这个错题的错误原因，才能杜绝出现类似错误。没有纠错，没有思考，就没有进步。

[14] Ichijo T,Voutetakis A,Cotrim AP,et al.The Smad 6-histone deacetylase 3 complex silences the transcriptional activity of the glucocorticoid receptor:potential clinical implications[J].J Biol Chem,2005,280:42067.

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