现代月季(Rosa hybrid)属于蔷薇科(Rosaceae)蔷薇亚科(Rosoideae Focke)蔷薇属(Rosa L.)的一类重要的多年生观赏植物类群[1].现代月季种类繁多，与原种蔷薇杂交频率较高，而且基因突变频率较高[2-4].现代月季多为中国月季传入欧洲后与各种蔷薇属植物杂交而成, 使得月季品种之间的亲缘关系表现得更为复杂和难辨[5-8].

ISSR(Inter-simple sequence repeats，简单序列间重复扩增多态性)分子标记是利用含有重复序列间区域并在3′或5′锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统[9]，具有高效、快速、成本低、多态性强等特点.目前，分子标记技术在蔷薇属植物的遗传育种和系统进化研究如品种鉴定、遗传多样性、基因分型、指纹图谱构建等方面应用较多[10-14]，但利用ISSR分子标记对月季植物的遗传多样性和品种鉴定的研究相对较少[15].本研究通过对ISSR-PCR反应的多因素探索，确定月季ISSR-PCR的最佳反应体系，并对14个月季品种的遗传多样性和品种亲缘关系进行探讨，旨在对月季品种的种质资源多样性进行评价，为月季品种选育和遗传改良提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料来源于南阳月季博览园随机采取的14份不同月季品种，采集时间为2017年3月中旬.将采集的新鲜幼嫩叶片带回实验室，用酒精和蒸馏水清洗，晾干后置于-20℃冰箱内保存.样品材料信息见表1.

1.2 基因组DNA提取

基于CTAB法，利用植物基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取基因组DNA.将提取到的DNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，于分光光度计中检测DNA浓度含量，稀释至50 μg/μL.

1.3 ISSR-PCR反应体系

利用正交实验设计，对DNA模板、引物、10×Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶五个因子进行梯度优化(表2).DNA的量为0.5 μL和1.0 μL，依次改变其他因素(Taq DNA聚合酶、10× Buffer、dNTP、引物)的浓度，PCR扩增选用的引物为UBC807，确定20 μL为最佳反应体系.

依据确定的最佳反应体系，利用所筛选出的7个ISSR引物进行ISSR-PCR扩增.PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，依据筛选TM值复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸6 min.扩增产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测.图1为引物UBC840的PCR多态性扩增图谱.

 

表1 供试月季品种信息

  

编号名称类型采集地1御用马车藤本月季南阳月季博览园2小女孩微型月季南阳月季博览园3新伊丽莎白藤本月季南阳月季博览园4光谱藤本月季南阳月季博览园5杰斯塔乔伊大花月季南阳月季博览园6电子表大花月季南阳月季博览园7红柯斯特微型月季南阳月季博览园8夏令营藤本月季南阳月季博览园9长虹藤本月季南阳月季博览园10橙柯斯特微型月季南阳月季博览园11金凤凰大花月季南阳月季博览园12粉和平大花月季南阳月季博览园13坦尼克大花月季南阳月季博览园14粉玫瑰王大花月季南阳月季博览园

 

表2 ISSR-PCR正交设计(单位：μL)

  

模板DNA引物10×BufferdNTPTaqDNA酶0．50．52．01．00．51．00．52．01．00．50．50．51．01．00．50．51．02．01．00．51．01．02．01．00．50．50．52．00．50．51．00．52．00．50．50．50．52．01．01．01．00．52．01．01．0

1.4 引物筛选

(2)通讯。包括贫困地区在内全国农村的基本通讯条件明显改善，城乡间基础通讯硬件的鸿沟基本消失。全国农村电话和手机通讯服务基本上已覆盖所有的村组，移动宽带设施已基本实现了行政村全覆盖。2017年全国贫困地区99%的自然村已通电话，81%的自然村能接收到有线电视信号，61%的自然村已安上了宽带，平均每个农户有2.1部手机。可以说，贫困地区农民对外信息交流的基础硬件设施已经具备，为缩小城乡间的数字鸿沟奠定了基本的物质基础。

 

表3 筛选的ISSR引物序列及其退火温度

  

引物引物序列退火温度UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGT50．5℃UBC817CACACACACACACACAA50．0℃UBC827ACACACACACACACACG52．0℃UBC836AGAGAGAGAGAGAGAGYA55．0℃UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT53．0℃UBC880GGAGAGGAGAGGAGA48．0℃UBC891HVHTGTGTGTGTGTGTG50．5℃

1.5 PCR扩增

目前，企业的财务会计发展过程中，面临着一个比较常见的问题就是在事情的处理上只注重事情的结果，从而忽略了事情的发展前提和过程，从而导致一些不必要的企业资金损失。比如企业在生产一件产品时，需要依靠市场的需求，如果财务部门在处理这件事情时只看重结果，导致产品面世以后销量脱节，对企业本身造成一定的经济影响。因为良好的预测可以使公司开发的新产品更加满足市场的需求，获得相应的经济利益。虽然产品后期还可以进行大整改总结，但是已经错过最佳的发布时间，失去了原创性意义。

1.6 数据分析

PCR反应体系的优化是ISSR分子标记进行准确和有效品种鉴定的关键，本研究通过对PCR反应体系的五个关键因子DNA模板、Taq DNA聚合酶、10×Buffer、dNTP和引物分别进行正交梯度优化，最终确定了能够进行高效和良好多态性扩增的PCR反应体系.

  

图1 引物UBC840扩增图

2 结果分析

2.1 ISSR-PCR反应体系优化

ISSR电泳条带显示即赋值为1，无带则赋值为0，然后输入二元矩阵.根据Nei&Li的方法计算遗传相似系数(GS)[16].利用NTSYS软件的SAHN模型，通过非加权算术平均法(UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic average cluster analysis)进行系统聚类分析.

2.2 ISSR标记扩增多态性

7条ISSR引物共扩增出60条DNA条带，扩增多态性位点52个，多态性位点百分率为86.0%(表4).大花月季扩增多态性位点占81.2%，微型月季扩增多态性位点占56.9%，藤本月季扩增多态性位点占80.0%，表明大花月季的遗传变异水平较高，微型月季的遗传变异较小.

根据 Nei’s计算不同月季品种间的遗传相似性系数(表5)，14份月季品种间的遗传一致度范围为0.50～0.85，平均遗传相似性系数为0.67，显示月季的遗传多样性水平相对较高.其中，电子表(大花月季)和橙柯斯特(微型月季)间的遗传相似性系数为0.50，其遗传一致度最低，遗传距离较大；粉和平(大花月季)和坦尼克(大花月季)间的遗传相似性系数为0.85，表明其遗传一致度最高，遗传距离较小.

2.3 月季品种间遗传多样性

什么是幸福课堂？幸福的课堂，应该是和谐、融洽的，机灵、开放、互动的，充满知识性、趣味性又能让学生体验到自己存在价值的课堂。随着心理学进入21世纪，关注人类幸福感的积极心理学运动日益声势浩大。积极心理学在教育界也得到了广泛响应。美国哈佛大学、英国惠灵顿学院及香港中文大学先后开设讲授积极心理学的幸福课，深受学生欢迎。本文将结合积极心理学的理论体系，探讨如何运用积极心理学构建小学幸福课堂。

本研究所用ISSR标记引物是从加拿大哥伦比亚大学(UBC primer set no.9，University of British Columbia，Canada)公布的100条ISSR随机引物中选取30条GC含量高的引物序列，由北京华大基因公司(BGI)合成.从30条ISSR通用引物中进行ISSR-PCR多态性引物筛选，利用1.5% 琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，最终筛选出条带清晰、稳定性好、多态性高的7条引物用于遗传多样性分析(表3).

 

表4 ISSR引物扩增结果及其多态性

  

引物总条带数多态性位点数多态性位点百分率UBC80710990．0%UBC817111090．9%UBC82710990．0%UBC8368787．5%UBC8409777．8%UBC8807685．7%UBC8915480．0%合计605286．7%平均8．67．486．0%

2.4 月季品种间亲缘关系

由UPGMA聚类关系图看出(图2)，在遗传相似性系数0.67处可以将14个月季品种划分为A、B、C三个明显的聚类分支.在A聚类分支中，御用马车(藤本月季)和小女孩(微型月季)聚为一类，显示两者的聚类亲缘关系较近.在B聚类分支中，新伊丽莎白(藤本月季)、光谱(藤本月季)、杰斯塔乔伊(大花月季)、电子表(大花月季)、粉玫瑰王(大花月季)、金凤凰(大花月季)、粉和平(大花月季)和坦尼克(大花月季)聚为一类，显示这八个品种的亲缘关系较近.在C聚类分支中，红柯斯特(微型月季)、橙柯斯特(微型月季)、夏令营(藤本月季)和长虹(藤本月季)聚为一类，表明这四个品种的亲缘关系较近.

3 讨论

目前，国内研究者采用分子标记技术对现代月季植物的遗传多样性进行了一定的分析.Debener等利用RAPD分子标记对10个栽培月季品种和9个野生蔷薇的遗传变异进行分析，发现栽培月季中存在相对较高的遗传多样性[17].本研究遗传多样性数据分析显示，不同月季品种间的遗传多样性水平也相对较高，与前人研究一致.邱显钦等通过对48份月季种质资源的遗传多样性和亲缘关系分析，结果表明云南月季种质资源具有丰富的遗传多样性，聚类分析将14个野生种明显分为6个组，与植物形态学分类结果基本一致[18].邱彤等对来自亚洲、欧洲、北美洲的51个现代月季品种作为试材进行SSR分析，发现遗传变异由高到低次序是欧洲月季、北美洲月季、亚洲月季，类群内变异是主要变异来源，欧洲与北美洲地区的现代月季遗传关系较近[19].本研究基于ISSR标记的UPGMA聚类图形成三个明显的聚类分支，在B聚类分支，大花月季(粉玫瑰王、金凤凰、粉和平、坦尼克)与藤本月季(新伊丽莎白和光谱)各自形成明显的聚类分支；在C聚类分支中，在遗传相似性系数0.79处，微型月季品种(红柯斯特、橙柯斯特)单独聚为一起，藤本月季品种(夏令营、长虹)单独聚为一起，显示大花月季、藤本月季、微型月季三个园艺组的ISSR标记基因呈现明显的遗传分化；在A聚类分支中，藤本月季(御用马车)和微型月季(小女孩)聚为一起，表明这两个品种的亲缘关系较近；在B类分支遗传相似性系数0.75处，藤本月季(新伊丽莎白和光谱)和大花月季(杰斯塔乔伊、电子表)聚为一个小分支，显示两者亲缘关系较近，藤本月季与大花月季可能存在较近的亲本起源和遗传进化速度[15].大花月季、藤本月季和微型月季三类群中的月季品种并没有完全归类到各自所属的园艺类群中，暗示这三个类群之间可能发生过杂交和基因交换，一个品种可能包含了几个类群的遗传因子[5].

 

表5 月季品种的Nei’s遗传相似系数表

  

123456789101112131411．0020．701．0030．720．621．0040．700．700．721．0050．730．700．780．831．0060．650．650．770．820．781．0070．650．650．630．650．750．601．0080．630．700．620．630．670．650．681．0090．630．700．620．700．770．720．750．801．00100．550．550．530．520．580．500．830．620．651．00110．630．670．720．730．770．750．720．630．730．651．00120．620．690．630．620．650．600．600．580．680．570．721．00130．570．630．650．700．670．680．620．530．670．550．770．851．00140．580．550．670．720．750．670．670．580．650．530．680．670．721．00

  

图2 14份月季品种的UPGMA聚类图

本研究结果显示，ISSR分子标记能够将大花月季、藤本月季、微型月季三个园艺组较为明显的分类，研究结果与园艺型分类基本一致，表明ISSR标记可以为月季品种鉴定和品种选育提供一定的理论参考依据.

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参 考 文 献

[1] 陈俊愉.中国花卉品种分类学[M].北京:中国林业出版社, 2001:132-135.

[2] 贾元义,赵兰勇,王文丽,等.月季品种过氧化物酶同工酶分类研究[J].山东农业大学学报, 2005, 36(2): 172-174.

[3] 杜晓华,周瑞金,王雪菊,等.月季品种资源的分类与评价[J].广东农业科学, 2011,38(5): 106-108.

[4] 郭立海,金德敏,王斌,等.月季种质鉴定和多样性分析[J].园艺学报, 2002,29(6): 551-555.

[5] ESSELINK G D, SMULDERS M J, VOSMAN B. Identification of cut rose (Rosa hybrida) and rootstock varieties using robust sequence tagged microsatellite site markers[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 106(2): 277-286.

[6] MATSUMOTO S, KOUCHI M, YABUKI J, et al. Phylogenetic analyses of the genus Rosa using the mat K sequence: molecular evidence for the narrow genetic background of modern roses[J]. Scientia Horticulturae, 1998, 77(1/2): 73-82.

[7] MENG J, FOUGRE-DANEZAN M, ZHANG L B, et al. Untangling the hybrid origin of the Chinese tea roses: evidence from DNA sequences of single-copy nuclear and chloroplast genes[J]. Plant systematics and evolution, 2011, 297(3-4): 157-170.

[8] 刘永刚,刘青林.月季遗传资源的评价与利用[J].植物遗传资源学报,2004, 5(1):87-90.

[9] ZIETKIEWICZ E,RAFALSKI A,LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics,1994,20(2):176-183.

[10] 陈向明,郑国生,孟丽.玫瑰,月季,蔷薇等蔷薇属植物RAPD分析[J].园艺学报,2002, 29 (1):78-80.

[11] 周宁宁,张颢,杨春梅,等.绢毛蔷薇居群遗传多样性的SSR分析[J].西南农业学报, 2011, 24(5): 1899-1903.

[12] 邱显钦,唐开学,蹇洪英,等.云南大花香水月季居群遗传多样性的SSR分析[J]. 华中农业大学学报, 2011, 30(3): 300-304.

[13] RUSANOV K, KOVACHEVA N, VOSMAN B, et al. Microsatellite analysis of Rosa damascena Mill. accessions reveals genetic similarity between genotypes used for rose oil production and old Damask rose varieties[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2005, 111(4): 804-809.

[14] QIU X, ZHANG H, JIAN H, et al. Genetic Relationships of Wild Roses, Old Garden Roses, and Modern Roses Based on Internal Transcribed Spacers and matK Sequences[J]. Hort Science,2013,48(12):1445-1451.

[15] 周俐宏,张金柱,李振,等.利用 ISSR 揭示不同类型月季遗传多样性[J].基因组学与应用生物学,2009, 28(2):311-315.

[16] NEI M. Genetic distance between populations[J]. The American Naturalist, 1972, 106(949): 283-292.

[17] DEBENER T, BARTELS C, MATTIESCH L. RAPD analysis of genetic variation between a group of rose cultivars and selected wild rose species[J]. Molecular Breeding, 1996, 2(4): 321-327.

[18] 邱显钦,张颢,李树发,等.基于SSR分子标记分析云南月季种质资源亲缘关系[J].西北植物学报,2009,29(9): 1764-1771.

[19] 邱彤, 张军, 张文林, 等. 基于SSR 标记的现代月季遗传多样性研究[J].北方园艺, 2015, 39(14): 115-117.