犬瘟热(Canine distemper , CD) 是由副粘病毒科副粘病毒亚科麻疹病毒属的犬瘟热病毒( Canine distemper virus, CDV) 引起的一种累及犬科和其他食肉目动物的高度接触传染性、致死性传染病。在临床上以双相热、卡他性鼻炎以及随后引起支气管炎、卡他性肺炎、严重胃肠炎和神经症状等为主要特征，且容易继发其它病毒或细菌的混合感染和二次感染。发病率几乎达100%，死亡率达30%～80%不等，素有“毁灭性传染病”之称。犬瘟热病毒为单股不分节段的、非重叠的负链RNA病毒。病毒粒子中的主要蛋白有核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、附着蛋白或血凝蛋白(H)。N蛋白是CDV中含量最高的结构蛋白，N蛋白构成螺旋状的壳体，供RNA结合。N蛋白是具有免疫原性的保守结构蛋白。N蛋白上含有B淋巴细胞抗原表位，在细胞免疫方面有着重要作用；且N蛋白与病毒的毒力密切相关，在病毒感染时可引起强烈的抗体反应，尤其在感染初期F和H蛋白特异性抗体低于检测水平时，N蛋白特异性抗体仍能被检出。因此，N蛋白在犬瘟热诊断上具有重要意义。本研究旨在克隆CDV-N截短体基因，并构建其原核表达产物，纯化CDV-截短体蛋白，为制备CDV单克隆抗体和胶体金诊断试纸条奠定基础。

目前的天眼系统主要侧重于防汛抗旱水文气象监测信息和中短期降水预报信息的应用，缺乏气候特征监测信息应用。未来两三年内系统将陆续收集历史和实时气候特征监测信息，建立气候特征数据库，实现气候特征监测信息查询应用和中长期降水预测的制作应用。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

感受态细胞DH5α和BL21，pMD18T-CDV-N和 pET30a质粒为本实验室保存，pMD18-T质粒购自大连宝生物公司。

1.2 主要试剂

LA Taq 酶、DNA marker购自大连宝生物公司，限制性内切酶Bam HⅠ、HimdⅢ、T4 DNA连接酶、蛋白预染marker 购自Fermentas 公司，鼠源性His标签单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG 购自北京康为公司； Ni-NTA agarose购自德国Qiagen公司。

1.3 CDV-N截短体基因克隆

CDV-N基因全长1572bp，共编码523个氨基酸。用DNAStar 软件预测CDV-N588蛋白B细胞抗原表位，选择其中抗原表位集中的一段(氨基酸位点：328-523)用于原核表达。用Primer Premier 5.0软件设计CDV-N截短体上游引物 5'-TATGGATCCTCCTACCCACTGCTCT-3' 及下游引物 5'-CCCAAGCTTATTGAGTAGCTCTCTATC-3'。上游引物中引入BamH I 酶切位点，下游引物中引入Hind III 酶切位点(下划线部分)，预期扩增片段长度为588 bp。引物由广州invitogen公司合成。以pMD18T-CDV-N 质粒为模板，PCR 扩增CDV-N截短体基因。 PCR 反应体系：LA Taq 0.5 μL 10×LA PCR Buffer 5 μL, dNTP 8μl, 模板1μL ，上、下游引物(25μM)各1 μl ，加水至50μl。 PCR 反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收。胶回收产物与pMD18-T 载体16℃连接过夜，转化感受态细胞DH5α，LA 平板培养过夜，挑斑、增菌，小提质粒进行酶切鉴定。阳性质粒送广州invitogen公司测序。测序正确的质粒命名为pMD18T-CDV-N588。

1.4 CDV-N截短体基因原核表达载体构建

对pMD18T-CDV-N588和pET30a质粒用限制性内切酶Bam H Ⅰ和Himd Ⅲ 分别双酶切 ，分别胶回收CDV-N588片段和线性化的pET30a，T4 DNA连接酶16℃连接过夜, LA 平板培养过夜，挑斑、增菌，小提质粒进行酶切鉴定。阳性质粒送广州invitogen公司测序。测序正确的质粒命名为pET30a-CDV-N588。

1.5 His-CDV-N588 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

应用Ni-NTA 琼脂糖珠在变性条件下纯化的His-CDV-N588融合蛋白呈现单一条带(图7)，纯度高。纯化前后的蛋白样品经Western blotting 检测，均呈现预期大小的蛋白条带(图8)，证明笔者确实获得了His-CDV-N588融合蛋白。

1.6 His-CDV-N588 融合蛋白纯化

Bam HI 和Hind Ⅲ 双酶切原核表达质粒pET30a-CDV-N588，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶图片上显示了约5.9 kb和0.6 kb预期条带(图5)，结果表明原核表达重组质粒构建成功。

孩子们的话竟让我有些不知所措。说实话，这群孩子还是挺听话的，上课时很安静，极少有交头接耳的，尤其是做笔记，是我见过的学生中最自觉的，名列前茅的期末考试成绩也一直让任课教师引以为豪。然而，我眼前却不禁出现了这样的画面：早读课，教师把事先准备好的多音字、反义词练习布置给学生，孩子们老老实实地埋头苦抄；本应活跃的课堂，却如一潭死水。

观察两组糖尿病患者经不同检查方式后的临床检验准确率情况；比较两组糖尿病患者经不同检查方式后的临床总检验有效率情况。

1.7 His-CDV-N588融合蛋白Western blotting检测

学生在这之前解答此题时，画线是直观的，思考也是借助图形的直观思维，虽然也有推理，但这里推理图形的直观成分比较大，所以他们的解答还是离不开形象和直观的。此时，当学生满足于刚才得到的结论时，教师再次提问：你们能不能画一条线，把长方形分成两个大小、形状都不同，但周长还是一样的图形呢？

2 结果

2.1 CDV-N截短体基因PCR扩增

重组质粒pMD18-T-CDV-N588 经Bam HI和HindⅢ进行酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶图上出现了约2.7 kb和0.6 kb的预期条带(图2)，表明该重组质粒为阳性。与GenBank上己公布的同名基因(登录号：HM596308.1)相比较，核苷酸序列(图3)和推导的氨基酸序列(图4)相似性为均为99%。

2.2 pMD18T-CDV-N588重组质粒酶切鉴定和测序

CDV-N588PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小约为0.6 kb左右的片段，与预期长度一致(图1)。

分别收集少量非纯化菌体蛋白和纯化了的His-CDV-N588融合蛋白，进行SDS-PAGE，用湿转法将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，用TBST缓冲液漂洗10 min, 然后用TBST配制的3%BSA, 4℃封闭过夜。弃去封闭液，加入用封闭液稀释的His单克隆抗体(1∶500)室温孵育2 h, 然后4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min, 加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶1500), 室温孵育2 h, TBST洗膜3次，每次10 min。加入化学发光剂A、B作用5 min, 在暗盒内压X光片(转印膜蛋白面朝上)，曝光、显影和定影。用预染蛋白marker判定目的蛋白的相对分子量。

M: DNA marker DL 2000；

1: CDV-N截短体基因PCR产物 图1 重组质粒pMD18-T-CDV-N588酶切鉴定

M1：DNA MarkerDL 2000；

1-2:重组质粒酶切产物；

M2：DNA标准DL 5000 图2 重组质粒pMD18-T-CDV-N588酶切鉴定

图3 CDV-N截短体基因测序结果

图4 推导的CDV-N截短体基因氨基酸序列

2.3 CDV-N截短体基因原核表达载体构建

将重组菌按1∶50的体积比对接1000 mL含50 mg/L 卡那霉素的LB培养基中，37℃恒温摇床培养至OD590=0.8时，加入1 mmol/L的IPTG诱导表达，4 h后收集菌体。随后的蛋白纯化按照Qiagen公司Ni-NTA argrose使用说明进行操作。离心收集菌体沉淀，每1 g沉淀湿重加5 mL Buffer B(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 8.0) 重悬菌体，置于室温下振摇，超声破碎10 min, 12000 rmp离心15 min，收集上清。按1∶4比例，将50%Ni-NTA琼脂糖珠和菌体裂解液上清装入纯化柱，室温下置水平摇床振摇60 min混匀，过柱。用2倍柱床体积Buffer C(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 6.3)洗脱3次，用2倍柱床体积Buffer D(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 5.9)洗脱1次，再用用2倍柱床体积Buffer E(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 4.5)洗脱His-CDV-N588 融合蛋白，洗脱5次。分别收集少量菌体裂解液上清、沉淀、过柱液、Buffer C和Buffer E洗脱品进行SDS-PAGE分析。

M1：DNA marker DL 5000；1：Bam HI和HindⅢ 双

酶切后的pET30a-CDV-N588；M2：

DNA marker DL2000 图5 原核表达质粒pET30a-CDV-N588酶切鉴定

2.4 重组质粒pET30a-CDV-N588在大肠杆菌中的诱导表达

将重组质粒pET30a-CDV-N588转化大肠杆菌BL21，经1 mmo/L 的 IPTG诱导表达和未诱导重组菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果显示IPTG诱导的重组菌液在相对分子量约30 KDa处有蛋白条带，而未诱导的重组菌液未出现此条带(图6)。

M：预染蛋白marker；1、3、5、7：未诱导的重组BL21；

2、4、6、8：用IPTG诱导的重组BL21 图6 pET30a-CDV-N588表达产物的SDS-PAGE分析

2.5 His-CDV-N588融合蛋白纯化

将酶切鉴定为阳性的重组质粒pET30a-CDV-N588转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，涂板，37℃培养过夜。挑取单个菌落，加入含有50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养(220 rpm )过夜。取重组菌按1∶50的体积比转接入含50 mg/L卡那霉素的15 mL LB培养基中，振荡培养至OD600=0.8 时，取少量菌液作为阴性对照，剩余菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在37℃中诱导表达4 h。收集菌液进行SDS-PAGE电泳分析。

上消化性胃溃疡引发出血是内科常见急症,患者临床症状主要为呕血,黑便等,严重的则导致贫血、头晕、血压降低,甚至休克或死亡;而肝硬化是造成上消化道出血的高危因素之一,所以针对肝硬化合并上消化性胃溃疡出血的患者积极有效的止血是治疗的关键[1]。本文主要研究分析奥曲肽与凝血酶联合治疗肝硬化合并上消化性胃溃疡的效果,将2015年到2017年收治的30例肝硬化合并上消化性胃溃疡的患者按照其治疗方式的不同分成两组进行回顾性分析,现将研究资料整理并作如下报道。

M：预染蛋白marker；1:未诱导的重组BL21;

2: IPTG诱导的重组BL21；3:菌体裂解物离心后的沉淀；

4：菌体裂解物离心后的上清；5：过柱液；6-8：

Buffer C洗脱杂蛋白；9：Buffer D洗脱杂蛋白；

10-14：Buffer E洗脱His-CDV-N588融合蛋白 图7 His-CDV-N588 纯化产物SDS-PAGE分析

M：预染蛋白marker；1:未诱导的重组BL21;

2:用IPTG诱导的重组BL21； 3-4:纯化的

His-CDV-N588融合蛋白 图8 His-CDV-N588纯化产物的Western blotting分析

3 讨论

近些年CDV-N基因的克隆、原核或真核表达研究主要选用N蛋白基因全长片段。本实验截取CDV-N基因B细胞抗原表位较集中的一段用于原核表达，获得了高纯度的His-CDV-N截短体融合蛋白，该片段可能比全长CDV-N基因具有更好的免疫原性。

近些年，笔者所在实验室在原核表达、蛋白纯化和多克隆抗体制备方面做了大量工作，经过长时间探索，发现真核基因在原核细胞中多以包涵体形式表达，用8 mol/L(pH 8.0)溶解包涵体，变性条件下纯化His标签融合蛋白行之有效，纯化后的蛋白无需复性，就可以直接免疫兔或鼠制备多克隆或单克隆抗体。这些前期研究建立的技术平台为CDV-N截短体基因原核表达和蛋白纯化提供了有力的技术支持。

表达载体上的6×His标签序列与Ni离子具有很强的亲和力， His标签蛋白结合能牢固结合在Ni-NTA 琼脂糖珠介质上。纯化过程中，杂蛋白富含组氨酸区域会非特异性地与Ni-NTA琼脂糖珠介质结合从而影响纯化效率。但蛋白是两性分子，带电性质可随pH的变化而变化，当杂蛋白洗脱液pH值与目的蛋白等电点pH值相近时，杂蛋白被洗脱;降低pH，可以减弱His标签蛋白与Ni离子的结合力，从而能洗脱并得到较高纯度的目的蛋白。本研究中CDV-N588蛋白的等电点pH值为5.4，笔者将杂蛋白洗脱液pH值调至6.3(Buffer C)和5.9(Buffer D)，目的蛋白洗脱液(Buffer E)pH调至4.5，有效地解决了杂蛋白污染问题。在纯化过程中，细胞破碎条件和裂解液过柱速率也影响纯化效果。超声波破碎功率太高和工作时间太久会产生气泡影响破碎效果，功率太低和间隔时间太短则会破碎不完全。工作5 s，间隔10 s，360 W作用30 min，是超声波破碎最佳条件；细胞裂解液过柱速率不能太快，否则会导致目的蛋白CDV-N588与纯化介质结合率下降，最佳过柱速率为30滴/min。通过对纯化过程的优化，我们顺利得到了His-CDV-N588融合蛋白。

4 结论

采用PCR技术，成功扩增了CDV-N截短体基因片段， 成功构建了CDV-N截短体基因原核表达载体， pET30a-CDV-N588在大肠杆菌中得以高效表达，纯化后的His-CDV-N588蛋白纯度较高，可用于单克隆或多克隆或抗体的制备。

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