乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，随着人口老龄化以及饮食结构的改变，我国乳腺癌的发病率逐年上升，并呈年轻化趋势[1]。流行病学研究提出内源性和外源性的雌激素是引发乳腺癌的主要危险因素。

雌激素是重要的内源性物质，在体内发挥着多种生物学效应[2-4]。此外雌激素在乳腺癌和子宫内膜癌等疾病的发展中起着重要的作用[5]。雌激素主要以雌二醇存在，与雌激素受体结合后产生多种生理作用[6]。雌二醇是雌激素中最主要、活性最强的激素[7]，目前普遍认为过量堆积的雌二醇在乳腺癌的发生、发展及预后中具有重要的作用[8-10]。雌二醇可被胞色素P450酶CYP1A1代谢为2-OH雌二醇，被CYP1B1代谢为4-OH雌二醇， 2-OH雌二醇和4-OH雌二醇通过儿茶酚甲基转移酶(COMT)转化为2-甲氧基雌二醇和4-甲氧基雌二醇。同时4-OHE2、2-OHE2可被代谢成雌二醇-3,4-半醌，半醌式结构进一步变成醌式结构，与细胞内DNA结构中嘌呤结合，形成DNA加合物，导致DNA的损伤，产生致癌作用[11]。

已有研究者建立方法测定血液[12]、尿液[13]、水体[14]、奶粉[15]中雌激素含量，然而对于细胞中雌激素的测定，相关文献报道较少，因此我们认为有必要建立一种细胞内快速的定量测量雌二醇及其代谢物浓度的方法，为研究雌二醇及其代谢在不同乳腺癌细胞内的药物代谢动力学行为提供基础。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1290 Infinity 超高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司)，AB SCIEX4500 三重四极杆串联质谱仪(美国 AB SCIEX 公司)，AB135-S 型十万分之一电子分析天平(德国梅特勒-托利多公司)，TG88/16-WS 台式高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，XW-80A 微型涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂有限公司)，LC-4016 型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，Millipore 超纯水系统(美国 Millipore 公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)。

1.2 试剂和药品 雌二醇对照品(批号：100182-201205 纯度：96.3%)、炔雌醇(批号：100052-200609 纯度：99.5%)均购自中国食品药品检定研究院；2-Hydroxy-17β-estradiol(批号：6-STB-57-6 纯度：96%)、4-Hydroxy-17β-estradiol(批号：6-STB-56-1 纯度：98%)均购自加拿大TRC公司；吡啶-3-磺酰氯(上海源叶生物科技有限公司批号：S62313 纯度：98%)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。DMEM高糖培养基(无酚红)、活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清均购自于Hyclone公司；胰蛋白酶购自Gibco公司。

2.5.1 方法专属性 取细胞空白裂解液，标准品混合溶液加内标溶液，空白裂解液加入标准品混合溶液、内标溶液，按“2.3”方法处理样品，“2.4”方法进样测定，得到三者的色谱图，由图1可知空白裂解液中的内源性杂质对待测物和内标的测定没有干扰，表明方法专属性良好。

含氢溶液静脉与局部应用——最广泛的临床应用。通过静脉或者局部使用富氢溶液是完全可行与安全的。氢生理盐水静脉注射的方式已经在多种疾病模型中得到应用，包括急性胰腺炎模型、失血性休克模型、急性听力损失模型等，并且显示出明显的治疗效果。目前，含氢透析液已经广泛应用于临床，富氢溶液可以有效降低透析过程中的氧化应激，改善患者的营养状况并增加患者的蛋白水平，提高患者的生活水平，极大地改善了预后。

2 实验内容

Skyline 3DGIS支持BIM图层 ，可以读取标准FBX BIM文件，保留所有几何信息和属性数据，支持空间查询和属性查询，可以在项目中添加模型信息和更新模型属性数据，增强协作性。因此，本文3DGIS采用Skyline软件，将FBX BIM模型导入到 Skyline 3DGIS中需要设置的参数如表1所示。

青蛙跳着来到一堆臭烘烘的牛屎旁，看见屎壳郎就问：“屎壳郎先生，打扰您了，请问这里离隔壁的大森林有多远呢？”

2.2 对照品溶液与内标溶液的配制 精密称取雌二醇，2-OH雌二醇、4-OH雌二醇适量，加甲醇配制成2-OH雌二醇、4-OH雌二醇浓度为100 ng/mL，雌二醇浓度为200 ng/mL的混合对照品溶液，于-80℃保存备用。精密称取适量炔雌醇 (IS) 标准品，用甲醇配制成5 ng/mL的炔雌醇储备液。

2.3 细胞样品处理 取100 μL样品，加入10 μL内标溶液，用1 mL甲基叔丁基醚萃取，涡旋后离心，吸取上清液并用氮吹仪吹干。吹干后加入150 μL吡啶-3-磺酰氯，再加入50 μL碳酸氢钠缓冲液(pH=10.71)，涡旋，于60 ℃进行水浴，40min后加入1 mL甲基叔丁基醚萃取，取上清吹干，再加入80%甲醇复溶，涡旋后离心，取上清液UPLC-MS/MS分析。

2.4 分析条件

2.5 细胞样品方法学考察

2.5.5 稳定性考察 分别考察了雌二醇及其羟基代谢物的低、高6个QC质控样品的室温放置2h的稳定性、自动进样器放置24h的稳定性及样品冻融3次稳定性，以上稳定性考察结果见表11。结果表明在上述条件下样品均稳定。

2.4.1 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC CSHTM C18(2.1mm×100mm，1.7μm);柱温：30℃；0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脱(0-6 min，38%A-48%A；6-6.5 min， 48%A-38%A；6.5-7 min，38%A-38%A)；流速：0.2 mL/min；进样量：2 μL。

2.1 MCF-7细胞培养 MCF-7细胞株(购自中国科学院上海生命科学研究所),将细胞接种于培养瓶，于37℃、5%CO2培养箱内，以含10%胎牛血清的 DMEM培养液在培养瓶内培养，取对数生长期细胞进行实验。细胞按5×105个每孔接种于6孔板，隔天给药。

1.3.2 带教满意度的调查。带教满意度包括了带教老师对实习学生的评价和实习学生对带教老师的评价。通过满意度的调差，及时发现实习学生实习过程中遇到的问题以及带教方法存在的缺陷，并及时调整和修改带教方案，促进实习带教的科学性，提高实习带教质量。

我国的最高反腐败机构应该是从宏观上领导、监督和协调全国的反腐败斗争，因此，该机构的名称，不能拘泥于“反贪污”、“反贿赂”、“检察院”等狭义名称，可考虑定名为“中央廉政总署”或“国家廉政总署”。

表1 雌二醇、羟基雌二醇及内标炔雌醇的质谱相关参数

  

化合物母离子子离子DP(V)EP(V)CE(V)CXP(V)雌二醇414．2350．21381038112-OH雌二醇571．2365．21301038114-OH雌二醇571．2365．2130103811炔雌醇438．2374．2157103811

  

A标准品混合溶液色谱图；B空白裂解液加标准品及

 

内标溶液色谱图；C空白裂解液色谱图(1.4-OH雌二醇；

 

2.2-OH-雌二醇；3.雌二醇；4.炔雌醇)

 

图1 雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇、炔雌醇色谱图

2.5.2 线性范围考察和定量下限 精密吸取空白细胞裂解液90 μL置于EP管中，分别依次加入系列浓度混合标准工作溶液10 μL，制备成雌二醇浓度为0.4、0.8、1.6、2、4、8、16、20 ng/mL，2-OH雌二醇浓度为0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10 ng/mL，4-OH雌二醇浓度为0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10 ng/mL的系列对照品细胞样品，按“2.3”方法处理样品，“2.4”方法进样测定。以细胞裂解液中各待测物的浓度X为横坐标，待测物的峰面积与内标峰面积之比Y为纵坐标，求得的直线回归方程即为标准曲线，见表3。以 10 倍信噪比(S/N=10)确定仪器的定量下限(LLOQ)，雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇分别为0.4、0.2、0.2 ng/mL。

2.5.3 精密度和准确度 精密吸取细胞裂解液90 μL，配制6份雌二醇及羟基雌二醇定量下限浓度(LLOQ)、低浓度(LQC)结果显示乙腈作为有机相时、中浓度(MQC)、高浓度(HQC)质控样品，雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇浓度分别为0.4、0.2、0.2，1.2、0.6、0.6，2.8、1.4、1.4，15、7.5、7.5 ng/mL，按“2.3”方法处理样品，“2.4”方法进样测定，记录各物质的峰面积，计算各药物的峰面积与内标的峰面积的比值，带入当天随行标曲并求得各药物的实际浓度，计算实际测定量与加入量的比值，进而求算准确度及日内、日间精密度,结果见表7-9。结果表明，该方法测定细胞中雌二醇及其羟基代谢物的日内及日间精密度均良好，满足生物样品分析要求。

表2 线性回归方程、回归系数r、定量下限

  

化合物回归方程(ng/mL)rLLOQ(ng/mL)雌二醇Y=0．2707X+0．08350．99850．42-OH雌二醇Y=0．3932X+0．0050．99870．24-OH雌二醇Y=0．3915X+0．02110．99850．2

2.5.4 基质效应考察 取细胞裂解液90 μL，分别加入低浓度、高浓度的标准品混合溶液10 μL, 配制成含雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇的LQC、HQC标准添加细胞裂解液的样本(n=6)，按“2.3”方法处理样品，“2.4”方法进样测定，记录各物质的峰面积均为A1，另用90 μL超纯水代替细胞裂解液。其他步骤同上，获得相应峰面积为A2，结果如表10所示，基质效应的计算公式为ME(%) = A1/A2×100%。由结果可知，雌二醇及其羟基代谢物、内标炔雌醇的基质效应均在85%～115%之间，即离子效应对本法结果测定影响较小，基本满足底物定量分析的要求。

2.4.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI源)，离子源温度为350℃，进行正离子模式扫描，检测模式为多反应监测(MRM)，源喷射电压为5500V，气帘气(CUR)为35psi，喷雾气为氮气，碰撞气为氩气，化合物具体质谱参数参见表1。

2.6 雌二醇细胞摄取实验 取对数生长期的MCF-7细胞，用含10%胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔5×105个细胞接种到6孔板，每孔体积1 mL ，置37 ℃、5% CO2培养箱中孵育过夜后贴壁，撤掉上清液，PBS溶液清洗三遍，然后加入含有雌二醇培养基2mL，雌二醇的作用终浓度为0.4μM、0.8μM、1μM，实验设6个复孔，药物作用时间为10、30、40、60、120、240、480、720min，在药物相应作用时间结束时撤掉药物，并用PBS清洗细胞表面4次，加入Ripa裂解液(含1%PMSF)200 μL，冰上裂解十分钟，收集细胞裂解液，然后以12000 rpm离心10 min，收集上清液，取一部分用于蛋白浓度测定，另一份按“2.3”方法处理样品，“2.4”方法进样测定，记录各物质的峰面积。最终细胞内的药物量用药物(ng)/蛋白质(μg)表示。

原则上，金融开放不仅影响金融中介部门的发展，同时也影响一国的股票和债券市场发展。从数据的可获得性考虑，由于金融中介发展的指标涵盖更多的国家，本文选择衡量金融中介发展的指标作为研究对象。

结果见图4和图5，MCF-7细胞中可以测得雌二醇及2-OH雌二醇，并呈剂量依赖性 细胞中2-OH雌二醇及雌二醇随着时间增加而增多，而4-OH雌二醇未能测得，可能由于雌二醇在MCF-7中不经过CYP1B1代谢，而经过CYP1A1代谢。

 

表3 细胞中雌二醇、2-OH雌二醇、4-OH雌二醇日内、日间精密度及准确度测定结果(n=6)

  

QCAdded(ng/mL)Intra-dayMean±SD(ng/mL)RSD(%)Accuracy(%)Inter-dayMean±SD(ng/mL)RSD(%)Accuracy(%)雌二醇0．40．353±0．0257．0988．250．342±0．0123．3685．431．21．129±0．11410．0594．081．129±0．0141．1994．082．83．084±0．3059．91110．12．980±0．2086．99106．41516．77±0．4762．84111．817．03±0．2601．53113．52-OH雌二醇0．20．190±0．02714．3594．900．182±0．0115．9891．060．60．572±0．07212．6295．330．549±0．0254．5891．501．41．194±0．0494．1285．291．322±0．13611．3594．427．57．715±0．1865．63102．98．546±0．2249．34113．94-OH雌二醇0．20．193±0．03417．3796．480．225±0．04318．95112．50．60．602±0．0396．40100．30．608±0．0101．71101．31．41．581±0．23314．76112．91．401±0．16711．94100．07．57．948±0．37110．35106．08．485±0．2868．96113．1

 

表4 MCF-7 细胞中雌二醇及其羟基代谢物 和内标基质效应(n=5)

  

QC化合物标准溶液峰面积(Area)∗104细胞样品峰面积(Area)∗104基质效应(%)(%)LQC雌二醇1．424±0．1461．483±0．170104．03±0．032-OH雌二醇1．096±0．1310．947±0．11091．75±0．054-OH雌二醇1．192±0．1441．009±0．13591．20±0．06炔雌醇3．702±0．3263．562±0．44295．97±0．04HQC雌二醇13．574±1．27515．094±1．262107．4±0．052-OH雌二醇12．024±0．91911．873±1．15198．64±0．044-OH雌二醇12．887±0．91212670±1．39899．69±0．06炔雌醇3．162±0．1853．154±0．29198．20±0．06

 

表5 MCF-7 细胞中雌二醇及其羟基代谢物 内标的稳定性考察(n=6)

  

化合物QC室温放置RSD(%)反复冻融RSD(%)自动进样器RSD(%)雌二醇LQC4．655．630．84HQC0．410．950．512-OH雌二醇LQC2．254．631．89HQC0．272．260．364-OH雌二醇LQC2．492．911．37HQC0．402．010．80

  

图2 雌二醇在MCF-7细胞中平均药量-经时变化曲线

3 讨论

本研究对流动相进行了筛选，分别考察了甲醇和乙腈作为有机相，结果显示乙腈作为有机相时，各药物响应值稳定性良好、分析时间缩短，基底噪音信号较小，因此选择乙腈作为本研究的有机相。此外加入0.1%甲酸，可以显著提高待测物的离子化效率。

  

图3 2-OH雌二醇在MCF-7细胞中平均药量-经时变化曲线

考虑到雌激素为低极性的化合物，缺少可离子化的基团，质谱响应信号较低，针对这一问题，衍生化可以提高其离子响应，本实验比较了衍生化试剂丹磺酰氯和吡啶-3-磺酰氯的离子化效率，发现吡啶-3-磺酰氯效果更好，还考察了碳酸氢钠缓存液的pH值对于质谱响应的影响，发现pH为10.71时响应最大，此外对衍生化时的温度及时间也进行了考察，发现温度60℃为宜，时间为40分钟，温度和时间不可过高，否则质谱响应将降低。关于萃取试剂的选择，发现甲基叔丁基醚的萃取效果比乙酸乙酯更好。

细胞实验中，我们也尝试测过给药后细胞培养基中的药物量，发现细胞外液中可以测到4-OH雌二醇，而实验结果发现细胞中没有，这可能由于4-OH雌二醇可导致基因突变，细胞出于自身保护而做出的一种自发的外排行为。

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