0 引言

凝血酶(thrombin)早在19世纪末就被苏格兰的一位生理学家Buchanan所发现，它是机体凝血系统中的天然成分，能够裂解蛋白结构中的肽键，参与凝血过程的各个环节.凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，凝血瀑布学说认为凝血过程是一系列酶促反应，每个凝血因子都被其前一个相关因子所激活，最后生成凝血酶和纤维蛋白[1].凝血酶在血液的凝结过程中起着重要作用，凝血酶在血液的异常水平可以引起凝血障碍，肾功能衰竭[2]、类风湿性关节[3]、炎肺纤维化[4]和肾小球肾炎[5]，故对其在机体内的含量研究显得尤为重要.在过去的时间里有许多检测方法已经被开发用于检测血液中的凝血酶，包括电致化学发光法[6]，电化学方法[7-10]，基于抗体的放射免疫测定法/ELISA[11]，荧光标记底物结合的生物传感器[12-14]，还有以核酸探针为基础的适配体传感器[15-17]，表面等离子共振法[18]等.

为了避免偏见，发明了算法，让大数据帮我们做出判断，但算法偏见的频频涌现却难免让人们对人工智能侵犯公众权利、引发政治风险产生忧虑与担忧。因此，明晰算法政治风险的发生逻辑，对于其治理及发展前景无疑具有十分重要的意义。算法政治的风险主要存在于两个领域，一个是基于算法自主决策系统的辅助政治决策领域，一个是基于算法的政治传播领域。然而，它们的发生逻辑却是迥异的，前者主要由算法的内在缺陷引起，后者则是算法应用的副产品，是政治传播的产物。洞悉算法政治风险的发生逻辑非常关键，这既是理解算法政治风险何以发生的内在机理，又是预防与治理算法政治风险的前提。

核酸适配体是指利用指数富集的配体进化技术[19-20](SELEX)从特定的寡核苷酸文库中筛选出能与靶分子特异性结合寡核苷酸(DNA或RNA)，其中的靶分子包括蛋白质、无机离子、DNA、RNA，以及其它小分子物质.

15个碱基的凝血酶适配体是第一条从文库中筛选出来的适配体[21]，能特异性结合凝血酶蛋白.本文基于合成的复合材料构建荧光生物传感器用于检测凝血酶.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

凝血酶(thrombin)从Sigma Aldrich公司购买，三羟基甲基氨基甲烷(Tris)和修饰有FAM的凝血酶适配体由上海生工生物科技有限公司提供.适配体和凝血酶的冻干粉末均保存在-20 ℃，使用前配置适当浓度的溶液在4 ℃保存.所有其他化学品至少为分析纯试剂，没有进一步纯化.本实验用水均为Milli-Q系统净化的超纯水(电阻率为18.25 MΩ·cm-1).

2.2.1 材料用量优化

1.2.1 Fe3O4@g-C3N4@MOF复合材料的制备

为了验证方案的可行性，先用材料吸附适配体，反应半个小时以后，用磁铁分离取上清液测定此时的荧光(图1B，曲线e)，之后在体系中加入浓度分别为100、10、1 mmol·L-1的凝血酶，反应4 h后用磁铁分离取上清液测定此时的荧光(相应的得到图1B，曲线b、c、d).如图所示，曲线e相比曲线a有较大程度的猝灭，猝灭效率EQuench=86.65%，不同浓度凝血酶的加入使荧光出现不同程度的恢复，这一现象证明了传感器的可行性.

1.2 实验步骤

凝血酶适配体DNA序列：5’-FAM- GGT TGG TGT GGT TGG-3’.

1.2.1.1 g-C3N4纳米片的合成

影院界面展示了城市影院列表，用户可以根据对区域的选择以及影院品牌的选择进行影院查询结果的筛选。筛选功能是通过对Ionic框架的Select组件自定义样式实现的。

参考文献[22]合成了g-C3N4纳米片：双氰胺 1g(12 mmol)置于马弗炉中从室温以2.3 ℃·min-1的升温速度加热到550 ℃，并在550 ℃保持4 h.对得到的g-C3N4进行剥离以获得单层的g-C3N4纳米片.称取0.3g g-C3N4分散于200 mL的去离子水中，连续超声6 h进行剥离.将得到的分散液利用旋转蒸发仪进行浓缩，在330 K下浓缩至约50 mL，材料的浓度约为1.2 mg·mL-1.

1.2.1.2 Fe3O4 磁性纳米粒子的制备

Design of Fine Tourism Route and Construction of Landscape Elements of the Yellow River in Shanxi___________________________LI Xiuqing,HU Weixia,YAN Yu et al 24

合成好的复合材料Fe3O4@g-C3N4@ HKUST-1(magnetic gH hybrid composites)称取2.0 mg分散在4.0 mL水中，并持续超声30 min，备用.适配体溶液10 mmol·L-1在4 ℃保存，取20 mL用水溶液稀释至2.0 mL，适配体溶液浓度为100 nmol·L-1，溶液避光放置，备用.凝血酶以分子量36 KD计算，称取3.60 mg并溶解在1.0 mL的水溶液中，浓度为100 mmol·L-1，4 ℃保存备用.

1.2.1.3 Fe3O4@g-C3N4@MOF复合材料的合成

同Fe3O4 磁性纳米粒子的合成方法一样，复合材料的合成也是利用水热完成的.合成分3步，首先是称取1.087 g (4.5 mmol) 的Cu(NO3)2 ·3H2O，溶解在含有15 mL的水溶液中(其中含有10 mL前一步合成好的1.2mg·mL-1的g-C3N4纳米片)，然后加入15 mL溶解有0.525 g (2.5 mmol)的均苯三甲酸(H3BTC)的乙醇溶液，并利用磁力搅拌器搅拌30 min加速溶液混合均匀；接着，往混合溶液中加入0.3 g Fe3O4纳米粒子，持续搅拌10 min；最后将混合溶液转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜内，从室温加热至120 ℃反应12 h，然后自然冷却至室温，取出，将反应得到的溶液利用砂芯漏斗抽滤得到蓝色的产物，并用无水乙醇与超纯水分别清洗3次，之后将产物于100 ℃真空干燥.

1.2.2 溶液的配制

Fe3O4 磁性纳米粒子的合成在参考文献[23]的基础上进一步修改后的步骤如下:称取6.5 g的FeCl3·6H2O和2.0 g的柠檬酸三钠溶解在200 mL的乙二醇中，通过超声加速溶解，然后一边搅拌一边加入12 g的醋酸钠，并继续搅拌15 min，然后将溶液转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜内加热至200 ℃，并在200 ℃维持8 h.在此之后，自然冷却至室温，将产物利用去离子水和无水乙醇分别清洗3次，最后80 ℃真空干燥得到Fe3O4 磁性纳米粒子的黑色产物.

1.2.3 Fe3O4@g-C3N4@HKUST-1猝灭修饰有FAM的适配体的荧光

往含有材料溶液30 mL的体系中加入20 mL适配体溶液(100 nmol·L-1)和150 mL Tris-Hcl(50 mmol·L-1，pH 7.4)溶液，在金属浴中振摇不同时间后，利用磁铁离心吸取上清液测定其荧光.

1.2.4 凝血酶生物传感器

往含有材料溶液30 mL的体系中加入20 mL适配体溶液(100 nmol·L-1)和100 mL Tris-Hcl(50 mmol·L-1，pH 7.4)溶液，再加入不同浓度目标物凝血酶溶液50 mL，于金属浴中振摇不同时间后利用磁铁分离吸取上清液测定其荧光.

2 结果与讨论

2.1 传感器的实验原理

如图1(A)所示，先制备复合了g-C3N4、HKUST-1以及Fe3O4的纳米材料，当修饰有FAM的凝血酶适配体吸附到材料表面时，由于材料内π电子与FAM之间的产生荧光共振能量转移(FRET)，使FAM的荧光被猝灭.当体系中存在目标物凝血酶时，由于凝血酶适配体能与凝血酶特异性识别形成G-四联体结构从材料表面脱离，使材料与FAM之间的FRTC过程被阻断，适配体上修饰的FAM荧光恢复，利用磁珠将材料与脱离的适配体分离，取上清液在480 nm处激发测定荧光，能得到在520 nm处的发射峰，根据这一原理设计了对凝血酶进行检测的生物传感器.

所有的荧光光谱均在F4600(HITCHE F4600)荧光光谱仪上采集；所有的超声分散均在KQ-50B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Tris-Hcl的pH调节在Bante920精密pH/ORP计(上海般特仪器有限公司)；微量电子天平Sartorius BT25S(德国赛多利斯集团).

男性气质研究最早可以追溯到20世纪初的性别角色理论。20世纪后半叶，随着男性气质不断在社会学、人类学领域的拓展，男性气质逐渐成为一门独立学科。其中，R.W.康奈尔是男性气质研究中的巨擘。康奈尔认为男性气质是一种实践的过程，是在实践中所建构的。在她看来，“男性气质”可以被简要定义为“既是在性别关系中的位置，又是男性和女性通过实践确定这种位置的实践活动，以及这些实践活动在身体的经验、个性和文化中产生的影响。”

  

(A)原理图

  

(B)可行性研究

 

图1 基于复合材料构建的荧光传感器检测凝血酶原理图及可行性研究.

Fig.1 The principle and feasibility study of the biosensor based on magnetic gH hybrid composites to detect thrombin

M (magnetic gH hybrid composites) 50 mL was added in aptamer, and fluorescence was quenched(curve e)，but after thrombin added in , fluorescence recovery in varying degrees, a): aptamer; e): aptamer +50 μL M; b): e +100 μmol·L-1 thrombin; c): e +10 μmol·L-1thrombin and d): e +1 μmol·L-1thrombin. Excitation: 480 nm, and Emission: 520 nm.

2.2 传感器的条件优化

本区土壤中Cr含量变化范围为21.3～61.3 mg/kg，平均值为47.66 mg/kg，远远低于农用地土壤污染风险筛选值(150 mg/kg)[4]，表明本区土壤环境质量中单指标Cr处于清洁状态。

  

图2 材料用量优化图Fig.2 Optimization of material consumption Fluorescence intensity at different volume of material. Cthrombin=10 nmol·L-1, CTris-HCL=50 mmol·L-1(pH 7.4). Excitation: 480 nm, and Emission: 520 nm.

当材料浓度低时，适配体上的FAM不能被完全猝灭，会导致体系的背景信号较高，不利于提高传感的灵敏度；相反，若是材料过量则阻碍适配体与凝血酶特异性结合，只有加大凝血酶浓度才能出现荧光恢复，这将影响传感器的检测范围.所以，对材料用量进行优化显得尤为重要，如图2所示，向10 nmol·L-1适配体中加入不同体积的材料(50 mg·mL-1)，当材料加入到30 mL时，体系荧光猝灭效率EQuench =85.89%，继续增加材料量并没有出现较大的猝灭效率，因此选定材料体积为30 mL.

潜虬媚幽姿，飞鸿响远音。薄霄愧云浮，栖川怍渊沈。进德智所拙，退耕力不任。徇禄反穷海，卧疴对空林。倾耳聆波澜，举目眺岖嵚。初景革绪风，新阳改故阴。池塘生春草，园柳变鸣禽。祁祁伤豳歌，萋萋感楚吟。索居易永久，离群难处心。持操岂独古，无闷征在今。[12] (卷二二《石壁精舍还湖中作》，P1044)

2.2.2 传感器反应时间优化

材料对适配体的吸附以及适配体结合凝血酶后从材料表面脱附不是在一瞬间完成的，这两个过程都需要一定的时间去完成.如果在材料还没有完全吸附适配体时测定荧光，那么得到的数据必定背景值较高；若在凝血酶还未与适配体充分结合就把两者分离，将会严重影响传感器的灵敏度，也会使传感器稳定性受到影响；反之，若是反应时间过长适配体在材料上吸附很牢固，当加入凝血酶时，需要相比最佳值更长的时间去脱附，所以对传感器的反应时间进行优化是非常必要的.如图3 所示，对传感器反应的两个阶段进行了时间的优化，分别对应适配体在材料上的吸附阶段(猝灭阶段)，以及适配体结合凝血酶从材料上脱附的脱附阶段(恢复阶段).实验结果表明：当材料与适配体反应30 min后体系的荧光值达到最低，此时体系的荧光猝灭效率EQuench =87.08%，继续增加反应时间时，体系荧光没有出现更大的猝灭效果，所以选定猝灭阶段的时间为30 min；当吸附在材料上的适配体与凝血酶反应4 h后，体系荧光的恢复开始趋于平台期，此时荧光恢复效率为ERecover=339.8%.由此选定恢复阶段反应时间4 h.

 

 

A) Fluorescence quenching of aptamer (100 nmol·L-1) in Tris-HCl buffer by material as a function of time;

B) Fluorescence restoration of aptamer-M in Tris-HCl buffer by Thrombin (100 nmol·L-1) as a function of time. Excitation: 480 nm, and emission: 520 nm.

图3 传感器的时间优化图

Fig.3 Time optimization of biosensor

2.3 对凝血酶检测的线性范围和检测限

在对上述条件优化完毕之后，利用设计的传感器对凝血酶进行检测，不同浓度的凝血酶对体系荧光有不同程度的恢复，荧光信号在凝血酶浓度为1.25～20.0 μmol·L-1范围内有较好的线性，线性方程为：y=16.03x+114.52，回归系数R2 = 0.998 3.传感器对凝血酶的最低检测限LOD=372 nmol·L-1 (S/N=3).

江苏东临黄海,海岸线以偏南北走向为主,如图1所示,东侧黄海区域的海风向西侧内陆推进的过程中,形成与海岸线走向接近的温度锋区。由于海陆风与海风锋均为强度偏弱系统,因此它们的显现需要稳定的天气形势背景,以及明显的海陆热力差异。强烈的大尺度天气过程如寒潮冷锋,热带台风等具有强势系统性风场,它们将掩盖沿海海陆风和海风锋。因此有利的天气背景是沿海由相对稳定的、尺度和强度中等的高压或高压边缘控制。

 

 

A) Fluorescence spectra after incubation with varying concentrations of thrombin (a) 20 μmolL-1; (b) 15 μmolL-1; (c) 10 μmolL-1; (d) 5.0 μmolL-1; (e) 2.5 μmolL-1; (f) 1.25 μmolL-1; and (g) Material quenching

B) Plot of fluorescence intensity versus Thrombin concentration. FAM-aptamer=100 nmolL-1, magnetic gH hybrid composites=50 mg·mL-1. Excitation: 480 nm, and Emission: 520 nm.

图4 传感器对凝血酶检测的线性考察

Fig 4 Linear study of biosensor in testing thrombin

  

图5 传感器检测凝血酶的选择性考察 Fig 5 Selective study of biosensor in testing thrombin for thrombin over other substance in blood Fluorescence intensity based on FAM-labeled aptamer-magnetic gH hybrid composites toward different substance in blood respectively with L-cys, Glu, L-His, and magnetic gH hybrid composites quenched. Thrombin= 20 μmol·L-1, L-Cys=1.0 μmol·L-1, Glu=1.0 mmol·L-1, L-His=1.0 mmol·L-1, aptamer=0.1 μmol·L-1.Excitation: 480 nm, and Emission: 520 nm.

2.4 传感器的选择性研究

选用L-半胱氨酸，L-组氨酸以及葡萄糖进行选择性试验，实验结果如图5所示，干扰物质浓度为目标物质五十倍时传感器对凝血酶的响应信号仍然最好，其他物质的响应信号较小，说明凝血酶与其适配体的特异性作用较好，传感器的选择性良好.

(3) 土地开发度：车站周边土地开发强度越高，各种用地性质种类(居住、商业、办公和休闲服务等)越多，线路全日客流的强度就越有保障。本文通过统计车站周边600 m范围内的建筑面积，计算周边用地混合度得到每个车站的折算系数，然后将两者相乘得到车站周边土地开发度指标。

3 小结

综上所述，本实验合成的Fe3O4@g-C3N4@HKUST-1既大大提高了金属有机骨架材料在溶液中的稳定性，又通过MOF上较为丰富的π电子提高了g-C3N4对生物分子的亲和力，使两种材料在生物传感器方面的应用得到较大程度的拓展.基于合成的材料构建了对凝血酶特异性识别的生物传感器，该传感器具有良好的稳定性和选择性，对凝血酶的最低检出限为372 nmol·L-1.该传感器制备简单，适用于多种生物分子的检测，具有良好的应用前景.

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