0 引言

百香果（Passiflora edulis）又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，在广西区内大量栽培.百香果果皮是其果汁加工的主要副产物.研究证明百香果果实中，果皮占鲜重的50%～55%，其中含有丰富的碳水化合物、多糖、黄酮和多酚类物质［1］.丰富的生物活性成分使其具有抗炎、抗焦虑和镇静功能、抗成瘾功能、抗氧化等作用［2］.Reza等［3］证实百香果果皮中的黄酮能抑制炎症因子的释放，可缓解炎症.Maria等［4］证实百香果外壳的乙醇提取物对中性粒细胞活性氧化物和髓过氧化酶的抑制作用强于浆果中的提取物.

国内对百香果果皮的研究主要是利用果皮制作果酱与果脯［5］、提取果胶［6］，或者是对百香果果皮的化学成分进行分析，而对果皮中总黄酮提取工艺的研究鲜有报道.黄酮类物质的提取方法有热回流法、索氏提取器提取法［7］、微波辅助提取法、超声波辅助提取法［8］、逆流提取法［9］等.逆流提取方法可确保药材与溶剂之间始终保持较大的有效成分浓度差，提高提取效率，节省溶剂用量，从而降低后续操作的能耗［10］.本试验采用逆流提取法提取百香果果皮中的总黄酮，通过正交试验优选出最佳工艺方案，并与其他提取方法比较，以期为百香果的综合利用提供一种可行的方法.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

百香果，购于柳州市，用前经粉碎过100目（150μm）筛，60℃干燥保存备用.

芦丁标准品，生化试剂，上海金穗生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯.

RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；752N紫外分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；CW-2000超声-微波协同萃取反应仪：上海新拓分析仪器科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 三级逆流提取

1.2.8 验证试验

要合理安排教学，注意教学时数和教学学期。基于此学科特点和学院实际，警察礼仪课程应在新生入学军训后的第一学期开设，用24学时完成教学，其中理论知识占6学时，礼仪训练占18学时。保证每位学生都能获得良好的警察礼仪教育。

精密称取1.00 g干燥的百香果果皮粉末置于圆底烧瓶中，加入60 mL的70%乙醇溶液，60℃下提取40 min，按照三级逆流提取流程进行提取，提取流程如图1所示.提取完后趁热减压抽滤得供试样品溶液备用.

精密称取1.00 g干燥的百香果果皮粉末置于索氏提取器中，加入60 mL的70%乙醇溶液，60℃下提取2 h.提取完后趁热减压抽滤，得供试样品溶液备用.

  

图1 三级逆流提取工艺流程图Fig.1 Processchart of three-stagecountercurrent extraction

3）正交试验：在提取级数确定的基础上，考察提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）对总黄酮提取率的影响，在单因素试验的基础上，按照正交表L9（34）进行正交试验.试验的因素水平表见表1.

(PS: The term dispositions refers to belief, attitude and value in NCATE Glossary.)

精密称取1.00 g干燥的百香果果皮粉末置于圆底烧瓶中，加入60 mL的70%乙醇溶液，60℃下提取2 h.提取完后趁热减压抽滤，得供试样品溶液备用.

目前国内的智能停车管理厂商已经有很多成熟的技术，能够帮助学校提高停车场的管理效率，学校可以引入找车位等APP，使车牌识别、智能倒闸和停车计费等共同提升停车场的管理水平。

1.2.3 索氏提取器提取

第二，适当的开展技能竞赛。高职院校学生在实际的学习过程，除了要认真学习教师以及师傅传授的技能之外，还应该积极的参加一些技能大赛，保证可以通过竞赛，不断提升水平，完善自身存在的不足。同时，院校也可以举办或者鼓励学生参加职业竞赛，让学生有机会学习不同院校以及学生的知识技能，领略来自不同职业的工匠精神，拓宽自身视野。此外，高职院校应该加大宣传，设立奖励机制，让学生可以了解竞赛的作用和意义，然后可以主动参与其中，提升自身能力和水平，促进自身未来发展。

1.2.4 超声波辅助提取

精密称取1.00 g干燥的百香果果皮粉末置于圆底烧瓶中，加入60 mL的70%乙醇溶液，超声功率为300 W、60℃条件下提取2 h.提取完后趁热减压抽滤，得供试样品溶液备用.

式中，c为总黄酮的浓度（mg/mL）；v为供试样品溶液体积（mL）；w为百香果果皮干粉质量（g）.

1）提取级数的确定：精密称取1.00 g百香果果皮粉末置于圆底烧瓶中，加入60 mL的70%乙醇溶液，60℃下提取40 min，提取级数分别为1、2、3、4、5级，加热回流提取.提取完后趁热减压抽滤，得供试样品溶液备用.

2）单因素试验：逆流提取法的主要影响因素有提取时间、乙醇浓度、料液比和提取温度.在逆流提取级数为3级的条件下，分别研究提取时间为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%，料液比为1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，提取温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的不同条件下单因素提取工艺.

1.2.2 常规热回流提取

1.2.6 标准曲线的绘制及供试品总黄酮含量的测定

完善的财税制度体系是国土资源部门进行财政税收预算管理工作的重要保障，预算管理工作的有效进行更需要财务等各个部门的共同配合。但是在实际的工作过程中，由于财税制度中关于预算管理的法律法规并不完善，致使一些部门如税收、纪检、国土勘探并不愿意积极参与预算编制工作，再加上部分预算人员对预算工作不重视，使得预算与实际情况相背离，无法实现其真正的功能。

1）标准曲线的绘制［11］：精确称取芦丁标准品5.0 mg，用适量的50%乙醇溶解，移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，得到质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁对照品溶液.精密量取0.1 mg/mL的芦丁标准液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至10 mL具塞比色管中，用50%乙醇定容至5 mL，精密加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后，精密加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀放置6 min后，精密加入4%的NaOH溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容至10 mL，摇匀后静置15 min后，以不加芦丁溶液的第一管为空白对照，在510 nm处测定吸光度，以吸光度y为纵坐标，芦丁含量x（mg/mL）为横坐标，做回归处理，得到标准曲线和回归方程：y=9.876 7x+0.028 3，其相关系数R2=0.998 4，表明芦丁标准溶液在0～0.06 mg/mL范围内线性关系良好.

2）供试样品的制备：将提取液在旋转蒸发仪下浓缩并回收乙醇，浓缩液用50%乙醇溶液定容至100 mL备用.

3）总黄酮含量测定：分别精密吸取不同提取液的供试样品溶液2.0 mL，按照标准曲线的测定方法，测定吸光度，根据下式计算总黄酮提取率：

 

表1 逆流提取法的正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test for countercurrent extraction

  

因素水平A/min B/（g·mL-1）C/（℃）1 2 3 35 40 45 1∶55 1∶60 1∶65 55 60 65

 

1.2.5 逆流提取工艺条件的优化

1.2.7 方法学考查

1）精密度试验：精密吸取芦丁对照品溶液2.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按照1.2.6项操作，重复测定6次，计算相对标准偏差（RSD）值.

2）重复性试验：采用三级逆流提取方法制备供试品溶液6份，按照1.2.6项操作，计算RSD值.

按照最优逆流提取方案平行制备5份提取液，按照1.2.6项操作测定吸光度，并计算总黄酮的平均提取率及RSD值.

4）加样回收率试验：量取已知总黄酮含量的百香果果皮提取液6份，分别精密加入相当于溶液中总黄酮含有量80%、100%及120%的芦丁标准品，按1.2.6项操作测定其吸光度，并计算加样回收率及RSD值.

肾素-血管紧张素系统(RAS)可导致NAFLD的发展[19]。CAO等[18]研究发现ACE2基因(血管紧张素转化酶2)敲除(ACE2-/y)小鼠表现出糖耐量受损和第一阶段胰岛素分泌减少，而RAS轴各组分干预肝脏代谢和炎症进程。本研究发现ACEI类药物对NAFLD有治疗效果。

3）稳定性试验：精密吸取供试品溶液2.0 mL，按照1.2.6项操作，每隔10 min测定吸光度，持续测定60 min，计算RSD值.

2 结果与讨论

2.1 方法学考查

精密度试验测得RSD值为1.09%，表明仪器的精密度良好.重复性试验测得RSD值为0.325%，表明试验重复性良好.稳定性试验测得RSD值为2.13%，表明供试品溶液在60 min内基本稳定.加样回收率测得平均回收率为97.68%，RSD值为2.54%，表明试验回收率高、准确度高.

2.2 不同提取方法提取白香果果皮中总黄酮

对常规热回流法、索氏提取法、超声波法和三级逆流提取法的提取效果和效率进行了比较.结果表明在相同的提取条件下，三级逆流提取的总黄酮提取率较高.结果如表2所示.

2.3 逆流提取级数对提取率的影响

不同逆流提取级数对总黄酮提取率的影响见表3.结果表明，总黄酮的提取率随着提取级数的增大而提高.当提取级数超过3级后提取率上升不明显，说明百香果果皮中的总黄酮提取已趋于饱和.但提取级数的增加将大大提高提取过程的动力消耗，故确定逆流提取的级数为3级.

2.4 单因素试验结果

2.4.1 提取时间对提取率的影响

然后噪声判断模块将噪声分类，若是高斯噪声，则将数据送往均值滤波模块处理；若是脉冲噪声，将数据送往中值滤波模块处理。而计数模块则对输入图像数据的行、列计数，确定所形成的窗口是否合法，并对合法窗口的数据进行计数，以确保滤波后的数据在一帧图像中。

本课题以参加“2018年江苏省定向锦标赛暨江苏定向邀请赛”中南京普通高校的带队教练、教师和这些学校的部分学生为调查对象并对其进行问卷调查与访问，研究南京普通高校定向运动的开展现状及可持续发展问题。

结果见图2.由图可知，总黄酮提取率随着提取时间的增加而增加.当提取时间为40 min时达到最大值，说明样品中的总黄酮基本提取完全.随后随着提取时间的延长，样品中其他醇溶性物质被浸提出来，导致总黄酮提取率下降.因此选取40 min作为最佳提取时间.

调查还发现，弯道在较低一侧的路面开裂比较高一侧严重，如表2所示，且较高一侧的部分裂缝是由较低一侧的裂缝延伸过去形成的，可见，较低一侧的开裂行为对整个路面开裂的影响不容忽视。

 

表2 不同提取方法的总黄酮提取率Tab.2 Extractionratesof total flavonoidswith differentextractionmethods

  

总黄酮提取率/%提取方法 平均吸光度1.57 1.53 1.87 2.07常规热回流法索氏提取器提取法超声波辅助提取法三级逆流提取法0.290 0.283 0.350 0.391

 

表3 不同逆流提取级数下的总黄酮提取率Tab.3 Extraction rates of total flavonoids under different countercurrent extraction stages

  

提取级数12345提取率/%1.571.732.112.122.16

  

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effect of extraction timeon theextraction rate

2.4.2 料液比提取率的影响

6）现代特色主题农园类型。如哈沙部落以鲁美写生基地为基础，不断开发和完善摄影绘画、书法写生等教育培训功能，同时围绕艺术创作，开发游客参与体验的娱乐活动，打造乡村文创艺术主题村，是第三批中国乡村旅游创客示范基地。

结果见图3.由图可知，总黄酮的提取率随着料液比的增加而增大，当料液比达到1∶60后提取率基本保持不变.这是因为随着提取溶剂用量的增加，增大了百香果果皮中黄酮类物质与溶剂两相界面的浓度差，从而提高了传质速率使总黄酮提取率上升.但当溶剂用量增大到一定程度后，物料中的总黄酮大部分已被提取出来，此时料液比对提取率的影响不明显.从节能降耗的角度考虑，适宜选用的料液比为1∶60.

2.4.3 提取温度对提取率的影响

结果见图4.由图可知，总黄酮的提取率随着提取温度升高而升高，并在60℃时达到最大值，随后提取率开始趋于平缓且呈下降趋势.这是因为随着温度增加，乙醇逐渐接近沸点，挥发速度加快，使乙醇溶液浓度下降，不利于黄酮类物质的溶出，而且随着温度升高，果胶等一些物质的溶出量也会增加.故选择60℃作为最佳提取温度.

2.4.4 乙醇浓度对提取率的影响

2018年，茅台酱香系列酒的目标，是在不增量的前提下完成从65亿元到80亿元的新跨越。这就要求茅台酱香酒公司实现产品优化升级，从高速度发展转向高质量发展。

结果见图5.由图可知，总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而增加，但乙醇超过70%后提取率开始下降，这可能是因为一些醇溶性杂质、色素、亲脂性成分的溶出量增大了，故选择70%乙醇作为最佳提取浓度.由于乙醇浓度在60%、70%、80%条件下得到的总黄酮提取率试验结果较为接近，试验偏差为0.09，考虑到逆流提取工艺流程在实验室操作的复杂性，故只选取提取时间、料液比和提取温度作为正交试验的考察因素.

2.5 正交试验结果

根据单因素试验结果，通过L9（34）正交表进行正交试验设计，以探明提取时间、料液比、提取温度对提取率的主次关系，并对其进行极差分析，以确定三级逆流最佳提取工艺.结果见表4.

Classroom scenario design is the creation of impromptu scenarios in the classroom,which can be divided into the following aspects:

  

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Effect of material tosolution ratioon theextraction rate

  

图4 提取温度对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate

  

图5 乙醇浓度对提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on theextraction rate

 

表4 三级逆流提取正交试验结果Tab.4 Results of orthogonal test for three-stages countercurrent extraction

  

试验号空列1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 K1 K2 K3 R A 111 2 2 2 3 3 3 B 123 2 3 1 3 1 2 C 1 2 3 3 1 2 2 3 1 123 1 2 3 1 2 3总黄酮提取率/%1.55 1.59 1.58 2.09 2.01 2.03 2.05 1.90 2.18 4.72 6.13 6.13 1.57 2.04 2.04 0.47 5.48 5.86 5.64 1.82 1.95 1.88 0.13 5.74 5.67 5.57 1.91 1.89 1.85 0.06 5.69 5.50 5.79 1.90 1.83 1.93 0.10

由表4分析结果可知，因素主次为A（提取时间）＞B（料液比）＞C（提取温度），最佳工艺条件为A3B2C1D3，即：提取时间45 min、料液比1∶60、提取温度55℃.

2.6 验证试验结果

分别在最佳工艺条件下，进行5次三级逆流提取平行试验，试验结果见表5.5次验证试验总黄酮提取率的平均值为2.18%，说明试验重现性好，提取的工艺方案稳定可行.

 

表5 三级逆流提取验证试验结果Tab.5 Results of verification test for three-stagescountercurrent extraction

  

试验号12345总黄酮提取率/%提取率平均值/%RSD/%2.122.202.242.162.17 2.18 1.39

3 结论

本试验以总黄酮的提取率为考查指标，通过单因素预试验和正交试验对逆流法提取百香果果皮中总黄酮的工艺进行研究，结果表明提取的最佳工艺条件为：逆流提取级数为3级，料液比1∶60，提取时间45 min，提取温度55℃，乙醇体积分数70%.在该工艺方案下总黄酮的平均提取率为2.18%，RSD值为1.39%.三级逆流提取方法与热回流提取法、索氏提取器提取法、超声波辅助提取法相比较，在相同的工艺条件下总黄酮的提取率更高，表明逆流提取方法使百香果果皮与提取剂之间始终保持较大的有效成分浓度差，减少了滤渣中溶质残留，可有效提高提取过程的效率.

精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验和验证试验结果表明，三级逆流提取工艺重复性好、回收率高，工艺方案稳定可行.

参考文献

［1］周玉娟，李宏伟，谈锋，等.黄果西番莲化学成分研究［J］.中药材，2009，32（11）：1686-1688.

［2］霍丹群，蒋兰，马璐璐，等.百香果功能研究及其开发进展［J］.食品工业科技，2012，33（19）：391-395.

［3］FARID R，REZAIEYAZDI Z，MIRFEIZI Z，et al.Oral intake of purple passion fruit peel extract reduces pain and stiffness and improvesphysical function in adult patientswith kneeosteoarthritis［J］.Nutrition Research，2010，30（9）：601-606.

［4］ZERAIK M L，SERTEYND，DEBY-DUPONTG，et al.Evaluation of the antioxidant activity of passion fruit（Passiflora edu⁃lis and Passiflora alata） extractson stimulated neutrophilsand myeloperoxidaseactivity assays［J］.Food Chemistry，2011，128（2）：259-265.

［5］唐万勇，罗桂兰.西番莲果脯加工工艺的研究［J］.中国林副特产，2002（4）：34-35.

［6］陈丽，韦运东，颜晓婷，等.碱溶酸沉与超声相结合法提取杮叶总黄酮的工艺改进［J］.广西科技大学学报，2017，28（4）：108-112.

［7］廖春燕，黄瑶，黄丽丹.鸡骨草总黄酮提取方法的比较［J］.广西科技大学学报，2014，25（2）：82-85.

［8］容元平，黄永春，赖君荣，等.超声波提取罗汉果中总黄酮的工艺研究［J］.广西工学院学报，2006，17（4）：5-8.

［9］黄永春，杨锋，何仁，等.草酸铵逆流萃取法提取西番莲果皮中果胶的研究［J］.食品科学，2008，29（9）：226-229.

［10］陈赟，田景奎.一种中药动态连续逆流提取的实验室模拟方法［J］.亚太传统医药，2006（1）：60-64.

［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2015.