0 引言

α-细辛脑（asarone），即（2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯）是天南星科植物石菖蒲（Acorustatari⁃nowii）的主要有效成分之一，又名α-细辛醚，可用于止咳、化痰、平喘，对肺炎、慢性气管炎均有较好的疗效［1］.α-细辛脑熔点低、脂溶性强，制成生物利用度高的口服固体制剂有一定困难［2］.

脂质体是临床应用较多的药物靶向传递系统之一［3］，但普通脂质体大多数情况下以混悬液的形式存在，长时间存放不稳定，易发生分层、凝聚、沉降、分解、药物渗漏等情况［4］.前体脂质体（prolipo⁃somes）是将脂质体膜材和药物的混合液在减压搅拌下逐步分布到一种可溶性固体载体表面，从而形成自由流动的粉体状制剂即为前体脂质体［5］，可解决普通脂质体存在的凝聚、渗漏等问题［6］.国内外学者对前体脂质体的制备和质量评价都进行了深入研究［7-8］，除本课题组前期制备的α-细辛脑前体脂质体之外［9-10］，目前鲜见其他关于α-细辛脑前体脂质体的报道.本文在课题组前期制备的基础上，采取Box-Behnken Design-响应面优化法（BBD-RSM）［11-12］，优化了α-细辛脑前体脂质体的制备工艺，考察了前体脂质体的稳定性及体外释放度，为把α-细辛脑前体脂质体开发成新药打下良好的基础.

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

α-细辛脑 （广西亿康药业，批号080626，含量98.6%）；胆固醇（AR，国药集团试剂公司）；卵磷脂（AR，德国利宝益）；甘露醇（AR，国药集团试剂公司）；甲醇（色谱纯，国药集团试剂公司）；维生素E（AR，国药集团试剂公司）；其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器

Agilent-1260型高效液相色谱仪（Agilent）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）（Agilent）；Millipore超纯水仪Direct-Q3 UV（默克化工技术有限公司）；EYELA N-1300v-WB旋转蒸发仪（岛津公司）；Microcon YM-50离心超滤管（50 kDa，0.5 mL，美国Milipore）；智能溶出度测试仪RC-3（天津市新天光分析仪器技术有限公司）等.

2 方法与结果

2.1 α-细辛脑前体脂质体的制备工艺

在本课题组前期实验的基础上［9-10］，甘露醇载体沉积法制备α-细辛脑前体脂质体.称取处方量的α-细辛脑、胆固醇、卵磷脂溶于无水乙醇中，称取少量维生素E溶解于上述无水乙醇中（维生素E与卵磷脂重比为1∶50），超声分散获得类脂质澄明溶液.然后称取处方量的甘露醇粉末加入上述类脂质溶液于旋转蒸发仪减压蒸干，干燥即得α-细辛脑前体脂质体.

2.2 α-细辛脑含量的测定［9］

色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB－C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇－水（65∶35，V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长：313 nm；进样量：20μL；柱温30℃.

计算机实验教学中心的所有计算机要组建内部局域网，并可接入国际互联网，每个实验室的互联网使用根据教学实际需求，由实验室教师实时远程控制网络开通与关闭。实验教学中心建设内部实验教学资源平台，并不断丰富实验教学资源内容，以满足教师教学资源下载、学生作业上传、无纸化考试等实验教学需求。

α-细辛脑在20～100μg/mL范围内与峰面积Y呈良好的线性关系，回归方程Y=41.49 x+16.38（r=0.990 3）；相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）为0.44%（n=5）；低、中和高3种剂量平均回收率分别为99.05%、101.20%和101.50%，RSD分别为1.44%、0.69%和0.80%（n=3），符合试验测定要求.

软件预测的最佳卵磷脂质量1.90 g，卵磷脂与胆固醇重比6.63∶1，卵磷脂与α-细辛脑重比为27.08∶1.该软件预测的优化包封率为93.36%.根据实际实验情况，在卵磷脂质量1.90 g，卵磷脂与胆固醇重比6.6∶1，卵磷脂与α-细辛脑重比为27.1∶1的条件下进行模型的验证实验，实验结果表明：α-细辛脑平均包封率为94.53%.该结果表明：该优化工艺稳定可靠，实验值与建立的模型预测值基本一致.

2.3 脂质体包封率的测定

采用Dseign-Expert 8.0.6.1对表2的数据进行分析，模型的方差分析表见表3，得二次多项式回归方程Y=92.39+3.21 A+1.72 B+2.30 C+1.14 AB-1.64 AC-1.69 BC-4.06 A2-4.65 B2-4.75 C2（R2=0.976 7，P＜0.000 1，F=32.56，失拟度检验p=0.093 6＞0.05，F=4.38）.

2.4 BBD-RSM优化α-细辛脑前体脂质体试验

在本课题组前期实验的基础上［11］，选3个对包封率影响较大的因素为自变量：卵磷脂用量（A）、卵磷脂与胆固醇重比（B）、卵磷脂与α-细辛脑重比（C），采用Dseign-Expert 8.0.6.1软件进行试验设计，以包封率（E）为响应值，共设计了17组试验，因素水平见表1，测定结果见表2.

 

表1 Box-Behnken因素水平Tab.1 Box-Behnken factor level

  

因素水平C A/g B-1 0 1 0.5 1.5 2.5 3 6 9 10 25 40

 

表2 Box-Behnken设计实验结果Tab.2 Box-Behnken design result

  

试验号B C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 A/g 0.00 1.00-1.00 0.00 0.00 1.00 1.00 0.00 0.00 1.00-1.00 0.00 0.00 0.00-1.00 0.00-1.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00-1.00 1.00 0.00-1.00 0.00 0.00 1.00-1.00 0.00-1.00 1.00 1.00 0.00 1.00 1.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00-1.00-1.00-1.00-1.00 0.00 0.00 1.00 0.00 E/%93.45 88.61 84.56 92.15 91.35 82.98 89.87 92.13 85.04 85.87 75.27 84.13 78.67 92.87 79.76 84.12 82.09

2.5 响应面法优化α-细辛脑的实验结果及模型拟合

称取α-细辛脑前体脂质体固体粉末溶解在生理盐水中得一定浓度的α-细辛脑前体脂质体混悬液，经破乳、过膜、离心后可得细辛脑前体脂质体离心液和混悬液，加甲醇溶解定容.精密量取20μL注入高效液相色谱仪，计算药物总浓度（x0）及离心液中游离药物浓度（x1），根据下式计算药物包封率［10］（E）.E=1-x1/x0 （1）式中，x1为游离药物的浓度，x0为脂质体中药物总浓度.

 

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

  

注：P＜0.05为显著水平，P＜0.01为极显著水平.

 

方差来源模型自由度A B C A B AC BC A2 B2 C2 F值32.56 52.42 15.08 26.94 3.31 6.84 6.49 44.32 58.06 60.52 P值＜0.000 1 0.000 2 0.006 0 0.001 3 0.111 5 0.034 7 0.038 3 0.000 3 0.000 1 0.000 1残差失拟值纯误差总和R2=0.976 7平方和459.73 82.24 23.67 42.27 5.20 10.73 10.18 69.53 91.09 94.95 10.98 8.42 2.56 470.71 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 4.380.093 6 R2adj=0.946 7

由表3可知试验设计所选择的3个因素（A、B、C）对α-细辛脑包封率均有显著的影响，其中AC、BC对α-细辛脑包封率也有显著的影响.模型F值较高（32.56），P＜0.000 1，说明拟合模型高度显著；失拟项F值较小（4.38），P＞0.05，失拟项不显著，该模型的信噪比高（16.608），方程的决定系数R2=0.976 7＞0.95，表明实测值与预测值之间有高度的相关性；其校正决定系数R2adj为0.946 7，表明模型响应值的变化有94.67%来源于所选自变量，说明模型在回归区域拟合良好，符合实验要求，可用该回归模型对实验结果进行统计分析［13］.

2.6 参数优化及模型预测

年轻时骑车，我载着你，你载着风;如今，白发满头压马路，你左手，我右手。人世间的爱情，还有什么比这更美好的？

图1 示出了在固定的卵磷脂与胆固醇重比（B）条件下，α-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与α-细辛脑重比（C）的交互影响.随着A和C的增加，响应值α-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂用量（A）为1.90 g时α-细辛脑包封率最高，分析可能的原因为：随着卵磷脂量的增加，磷脂所形成的脂质双分子层包裹的药物增加，从而包封率增加，但卵磷脂量继续增加，双分子膜的通透性和不对称性也会增大，可能导致药物渗漏增多从而包封率下降［13］.

  

图1卵磷脂用量及卵磷脂与α-细辛脑重比对包封率的等高线及响应面Fig.1 The contour and 3Dresponse surface of the entrapment efficiency on phospholipid and phospholipid：α-asarone

药膏粘贴：用愈裂膏或橡皮膏粘贴破裂严重的部位，药膏有封闭作用，可以让局部皮肤水分的蒸发减少到最低程度，迅速增加皮肤的含水量，软化皮肤，缓解破裂。

  

图2 卵磷脂与α-细辛脑重比及卵磷脂与胆固醇重比对包封率的等高线及响应面Fig.2 Thecontour and 3Dresponsesurfaceof theentrapment efficiency on phospholipid：α-asaroneand phospholipid：cholesterol

将制备的α-细辛脑前体脂质体固体粉末1 g置于封口袋中，α-细辛脑前体脂质体固体粉末1 g溶解后置于具塞试管中，每组设3个平行，将其分别放在层析柜（4℃）和室温（25℃）保存6个月，分别在1、2、3、4、5、6个月时取样进行渗漏率和包封率的测定.包封率的测定按照式（1）进行，渗漏率的测定按照式（2），稳定性实验结果如表4所示.

对政党而言，意识形态是政党的旗帜，对于统一思想、整合力量、凝聚人心、激励斗志具有重要作用。对于社会主义中国来说，意识形态安全是一个根本性问题，它事关党的前途命运和国家长治久安。世界社会主义运动的经验表明，作为国家安全系统的一个有机组成部分，意识形态问题处理得好不好，直接关系到社会主义国家的前途和命运。我们必须切实加强党对意识形态工作的全面领导，把意识形态工作的领导权牢牢掌握在手中，任何时候、任何情况下都不能旁落，否则就会犯无可挽回的颠覆性错误。

  

图3卵磷脂用量及卵磷脂与胆固醇重比对包封率的等高线及响应面Fig.3 Thecontour and 3Dresponsesurfaceof theentrapment efficiency on phospholipid and phospholipid：cholesterol

图3 示出了在固定的卵磷脂与α-细辛脑重比（C）条件下，α-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与胆固醇重比（B）的交互影响.随着A和B的增加，响应值α-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面。由图1—图3可以看出，图1—图2的3D图坡度比图3陡，这说明AC、BC交互作用对α-细辛脑包封率的影响比AB大，这与表3方差分析的结果一致.

2)通过仿真得到了X、Y、Z方向的切削力，通过铣削加工试验，获取铣削力数值并与仿真铣削力进行对比，验证了试验模型的准确性。为后续试验研究(加工效果，加工质量等)做好准备。

2.7 脂质体稳定性的考察

图2示出了在固定的卵磷脂用量（A）条件下，α-细辛脑包封率在卵磷脂与胆固醇重比（B）及卵磷脂与α-细辛脑重比（C）的交互影响.随着B和C的增加，响应值α-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂与胆固醇重比（B）为6.63∶1时，α-细辛脑包封率最高，过低的胆固醇浓度会影响脂质体成膜，胆固醇量增加，膜中双分子排列的紧密程度也增加，从而起到稳定双分子膜的作用，但是胆固醇量继续增加可能会使脂质体膜的刚性也增加［14］，总表面积减少，所包裹的药物量减少，从而包封率降低，胆固醇量的增加也会影响脂质体的稳定性［14］.

为确定α-细辛脑的最佳制备优化工艺，构建了三维曲面图，图1—图3显示了影响α-细辛脑包封率的自变量及交互影响.

 

式中，E0为未放置之前的药物的包封率，E1为放置一段时间之后的包封率.

由表1的结果可知，α-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃下放置6个月比较稳定，25℃放置6个月之后的渗漏率仍在10%之内.而25℃下α-细辛脑前体脂质体溶液渗漏率到第3个月已经达到20.74%，之后脂质体水溶液开始出现絮状沉淀，随着时间的延长絮状沉淀开始发黑，说明脂质体已经发生霉变和絮凝，而在4℃条件下无论脂质体的粉末还是水溶液都没有出现霉变和絮凝的状态.结果表明：α-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定.

 

表4 α-细辛脑前体脂质体稳定性实验结果Tab.4 The results of the stability ofα-asarone proliposome %

  

时间第1个月第2个月第3个月第4个月第5个月第6个月4℃放置α-细辛脑前体脂质体固体粉末渗漏率0.79 1.07 1.21 1.45 1.62 1.88 4℃放置α-细辛脑脂质体溶液渗漏率1.18 3.59 4.67 6.09 8.24 10.45 25℃放置α-细辛脑前体脂质体粉末渗漏率1.22 2.84 4.29 6.04 8.27 9.34 25℃放置α-细辛脑前体脂质体溶液渗漏率6.98 15.63 20.74— —

2.8 体外释放度的考察

取3批α-细辛脑前体脂质体的固体粉末溶解在生理盐水中，参照中国药典2015版溶出度的测定法——转篮法，以人工胃液（900 mL）为溶出介质，37℃下恒温振摇，100 r/min转速下每间隔1 h取样（同时补足等量人工胃液）、稀释、过膜注入高效液相色谱仪，进行α-细辛脑含量的测定［9］，计算累计释放率（3批样品平均值）.以时间为横坐标，样品各时间点的累积释放率为纵坐标绘制曲线，如图4所示.由图可知，在0～12 h内药物释放速度相对缓慢，12 h累积释药量90.21%.说明自制的α-细辛脑前体脂质体具有一定的缓释作用，能够为临床提供相对平稳的血药浓度，减少副作用的发生及给药次数.

将α-细辛脑的累积释放度（Mt/M∞）或待释放度（1－Mt/M∞）与时间（t）分别按零级方程、一级方程和Higuchi方程进行拟合，其零级拟合方程：Mt/M∞=0.066 5 t+0.233 1，r2=0.884 1；一级拟合方程：ln（1-Mt/M∞）=-0.198 8 t-0.074 6，r2=0.950 4；Higuchi拟合方程：Mt/M∞=0.272 3 t1/2+0.019 6，r2=0.992 1.结果表明Higuchi方程拟合的相关系数最大，R2＞0.99，因此采用Higuchi拟合的方程相关性最好.

  

图4 α-细辛脑前体脂质体的释药曲线Fig.4 Releasecurveofα-asarone Proliposomes

3 结论

前体脂质体是指将脂质材料吸附于载体上制备成的粉末状制剂，可提高制剂的稳定性，避免了用传统方法制备脂质体所存在的问题［6］.本研究采用载体沉积法制备α-细辛脑前体脂质体，以卵磷脂、胆固醇为膜材，甘露醇为载体，以包封率作为评价指标，采用Box-Behnken Design-响应面法对工艺条件进行优化，优化后的最佳工艺条件：卵磷脂质量1.90 g，卵磷脂与胆固醇重比6.63∶1，卵磷脂与α-细辛脑重比为27.08∶1.α-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定，其体外释放规律符合Higuchi方程.该优化工艺稳定可靠，α-细辛脑前体脂质体固体粉末可在室温条件下贮存，其在体外具有良好的缓释作用.

你说交通拥堵,给你限号了!你说私家车太多,给你摇号了!你说油不合格污染空气,给你把油价涨了!你说房价太高买不起,给你征税2 0%了!你说出租车不好打,给你把钱涨了!你说养老负担重.给你延迟退休了!你说国产奶粉有问题,今天直接药店上架当药卖了!你说!你说!你再说一句试试?

参考文献

［1］钱余义，陆瑾，张刘红，等.α-细辛脑经干粉吸入给药后在大鼠体内的药动学研究［J］.中国中药杂志，2015，40（4）：739-743.

［2］陆瑾，展冠军，郭立玮，等.PLA-α-细辛脑纳米粒的制备、表征及其对鼻黏膜的毒性［J］.中国实验方剂学杂志，2017，23（10）：22-28.

［3］任翔，刘琨，张莉.星点设计-响应面法优化积雪草苷阳离子脂质体的处方［J］.中国药房，2016，27（16）：2272-2275.

［4］仵文英，李莎，徐晓娜，等.苦参碱脂质体的稳定性及体外释放度研究［J］.中国药房，2013，24（37）：3542-3544.

［5］陈颖，黄海潮，朱庆玲，等.星点设计-效应面法优化α-细辛脑脂质体喷鼻剂的制备工艺［J］.中国药房，2013，24（5）：431-434.

［6］王健，李明轩.前体脂质体研究进展［J］.中国医药工业杂志，2005，36（11）：707-711.

［7］王小宁，贾慧婷，李伟泽，等.水飞蓟宾前体脂质体的制备及其质量评价［J］.中草药，2017，48（7）：1314-1320.

［8］LIU G J，WANG W，WANG H D，et al.Preparation of 10-hydroxycamptothecin proliposomes by the supercritical CO2 antisolvent process［J］.Chemical Engineering Journal，2014，243（4）：289-296.

［9］韦啟球，伍善广，冯学珍，等.α-细辛脑前体脂质体制备工艺的研究［J］.广州化工，2015，43（24）：84-86，163.

［10］韦啟球，冯学珍，张静，等.α-细辛脑前体脂质体的制备及其在大鼠体内药动学研究［J］.广东化工，2017，44（4）：21-23.

［11］刘宝彪，张昆明，黄永春，等.涡流空化强化载药壳聚糖微球制备效果初探［J］.广西科技大学学报，2017，28（3）：52-60.

［12］邓冬梅，何勍，孙宇飞，等.焦化废水中苯酚降解菌筛选及其降解特性［J］.广西科技大学学报，2016，27（4）：93-98.

［13］张丹，廖芳，周洁，等.Box-Behnken Design-响应面优化法优化芍药总苷脂质体的制备工艺及体外释放研究［J］.中草药，2015，46（3）：359-364.

［14］符华林，戴玉娇.磷酸泰乐菌素脂质体的制备及体外释放动力学研究［J］.中国兽药杂志，2010，44（10）：24-28.