槲皮素及其衍生物广泛分布在自然界壳斗类植物的根茎、枝叶和果实中，是一种游离态天然活性化合物[1]。它是一种具有广泛的生物学作用的黄酮类物质，槲皮素具有很好的抗氧化、降血压、抗衰老、抗肿瘤等作用，对于预防心血管疾病和糖尿病，调节机体免疫功能具具有很好的疗效[2]。在目前肿瘤防治中具有很好的前景。由于槲皮素及其衍生物是游离态物质，稳定性和抗氧化能力都比较弱，水溶性也较差，提取和保存难度较大，导致口服槲皮素效用减半，因而槲皮素的靶向给药成为目前医疗界的热点和难点[3]。若能将槲皮素制备为纳米粒（NP），借助其作为药物的载体将大大提高其效用，本文研究聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）的细胞相容性，制备槲皮素PLGA纳米粒，旨在为槲皮素的靶向给药提供方向，现报告如下。

基金项目：深圳市福田区卫生公益性科研项目＜槲皮素肠溶PLGA纳米粒的制备及体内外评价＞（FTWS2014047）

1 资料与方法

1.1 槲皮素PLGA纳米粒的制备：采用乳化挥发法的方法进行，采用超速冷冻离心法测PLGA纳米粒包封率和载药量，激光粒径测定仪测定粒径分布和Zeta电位值。制备PLGA纳米粒的前准备以下实验用品：20 g/L浓度的PLGA，15000分子量的PLGA（75/25），1%浓度的PVA，同时配置以下混合液，比例canzo参照如下：有机相中丙酮∶无水乙醇溶液=3∶1，有机相：水相体积=1∶50，药物：PLGA=1∶40，用于制备 PLGA纳米粒。溶液配备好用将槲皮素PLGA纳米粒胶体溶液稀释50倍，将稀释后的溶液滴至载玻片上，再由载玻片上滴至专用铜网上，等其粒子在铜网上沉积后用透射电镜观察纳米粒的形态并照相。

1.2 细胞培养和传代：取出冷冻储存在液氮中人角膜上皮细胞（HCEpic），放到 37℃温水中进行细胞培养。细胞入水后轻轻摇动温水帮助其进一步融化。等细胞完全溶于水中消完毒之后用吸管将细胞悬液吸出，滴入加好全培基的培养瓶中放进37℃培养箱，等待其培养。整个实验要求在超净工作台中操作，避免污染，培养期间隔天换液。细胞传代：将浓度为10%胎牛血清DMEM/F-12作为培养基放在37℃，5%CO2和湿度充裕的环境下培育。待到细胞分裂到培养瓶底面积 80%～90%的时候，加入0.25%胰蛋白酶EDTA液对细胞进行浸泡消化，消化5 min后将培养瓶内细胞放在倒置显微镜下面观察。观察到细胞回缩，细胞间隙逐步加大，同时部分细胞漂起的时候，再加入10%胎牛血清的全培基培养液终止消化，静置待下一步实验。

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1.4 统计学方法：采用SPSS16.0统计学软件，对两组定量资料比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3 细胞相容性检测：选取合适上升期并且发育良好的角膜上皮细胞，用0.25%胰蛋白酶EDTA液对其进行消化后配成浓度为105个/mL单细胞混合液。将混合液轻轻滴入每孔体积为100μL的96孔板，然后轻柔的将培养板放进CO2培养箱里面培育，培养箱温度为37℃，5%CO2及充分湿度模仿人体细胞生长环境。培养1 d后待到细胞贴壁后采用无血清培基对细胞同步化1 d。隔天对同步化后的角膜上皮细胞按浓度进行分组，0.2μg/mL为低浓度组，2μg/mL为中浓度组，20ug/mL分为高浓度组，稀释的药物溶液设为对照组。PLGA纳米粒为槲皮素PLGA纳米粒组，并按照浓度分为0.2μg/mL为低浓度组，2μg/mL为中浓度组，20μg/mL分为高浓度组。取100μL PLGA纳米粒在各孔中分别加入培基，培基作为空白对照，每组重复设置6孔确保实验精确。将各组溶液培养1 d后，用PBS溶液对其进行漂洗，之后再在各孔加入10μLCCK-8，于37℃条件下孵育2 h后即可通过酶标仪（450 nm）检测细胞增殖活力。

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2 结果

2.1 槲皮素PLGA纳米粒的性质：槲皮素PLGA纳米粒的包封率达（92.33±13.66）%，载药量达（21.33±1.02）%，粒子直径（113.24±21.36）nm，电位（-20.65±3.15）mV，详见表 1。

 

表1 槲皮素PLGA纳米粒的性质 （±s）

  

项目 载药量（%） 包封率（%） 电位（mV） 粒子直径（nm）槲皮素PLGA纳米粒 21.33±1.02 92.33±13.66 -20.65±3.15 113.24±21.36

人类健康与其应激行为密切相关，应激改变人们的心理和行为，对人们的各项功能有重要影响，尤其是心血管功能。患者长期强烈的应激行为，经常性的情绪和行为反应过激极易引发心脏疾病。研究表明，患者即使不存在主要的心血管疾病影响因素，长期过激的应激反应功能可通过对患者免疫，神经内分泌及代谢功能等其他功能影响人体心血管，长期积累极易引发动脉硬化导致严重的心血管疾病。槲皮素可软化人体毛细血管，扩张冠状动脉，加快冠脉血循环，防止血管内壁增厚变硬，减少毒害物质堆积，并增强肝脏缺血再灌注损伤的保护作用是防治心血管疾病的良药。槲皮素在肿瘤的形成过程中亦被证实具有抑制癌细胞的作用[4]。通过研究乙醇和链脲佐菌素处理的小鼠或大鼠模型得出槲皮素具有很好的抗氧化能力，然而其不稳定和难溶于水的性质使得其效用在用于人类疾病治疗中大大降低了。

 

表2 槲皮素PLGA纳米粒的细胞相容性 （±s）

  

组别 剂量（ug/mL）低浓度（0.2） 中浓度（2） 高浓度（20）对照组 0.821±0.021 0.647±0.015 0.521±0.002槲皮素PLGA纳米粒组 0.784±0.025 0.922±0.021 0.978±0.055 t值 2.110 4.651 5.211 P值 0.521 0.001 0.001

3 讨论

2.2 槲皮素PLGA纳米粒的细胞相容性：体外细胞毒性实验显示，与对照组比较，中浓度组和高浓度组的细胞活性增强，差异具有统计学意义（P＜0.05），但低浓度组的平均细胞活性未见统计学差异（P＞0.05），详见表 2。

在本研究体外释放实验中，槲皮素PLGA纳米粒的包封率达（92.33±13.66）%，载药量达（21.33±1.02）%，在37℃温度及pH为6.8的PBS溶液中的释放时降解更慢，释放介质逐渐扩散至纳米粒内部，药物溶解缓慢释放出来，进一步采用体外细胞毒性实验显示，与对照组比较，中浓度组和高浓度组的细胞活性增强，差异具有统计学意义，该结果提示槲皮素PLGA纳米粒可作为靶向给药方式，槲皮素制成PLGA纳米粒后单位面积内的药物浓度明显提纯，药效释放缓慢，可明显改善游离态的槲皮素药用价值。其机制可能是PLGA在无酶条件下降解缓慢，体外持续时间长。而且PLGA纳米粒具有良好的细胞融合及吞暖作用，细胞相容性好，药物一进到细胞内就降解，积累明显较少，细胞对药物浓度的耐受性提高，从而避免产生严重的免疫原性和毒性。PLGA可大大改善非水溶性药物的水溶性，提高药物缓释性，延长药物作用时间。同时，PLGA是极性与非极性分子的集合，该构成使其表面电荷很容易调节。

综上所述，槲皮素PLGA纳米粒具有很好的细胞相容性，能够提高局部用药的效用和安全性，是靶向给药的一个重要的研究方向。

(2)CDFU在应用过程中体现了很好的抗冲击能力，在试验来水水质波动较大(ρ(油)为15.0～61.0 mg/L，ρ(悬浮物)为20.3～46.5 mg/L)的情况下，出水水质满足两级精细过滤器进水要求(ρ(油)≤30 mg/L，ρ(悬浮物)≤30 mg/L)，有效保证了过滤器使用寿命及处理效果。

参考文献

［1］ Mundargi RC，Babu VR，Rangaswamy V，et al.Nano/microtechnologies for delivering macromolecular therapeutics usingpoly（D，-lactide-co-glycolide）and its derivatives［J］.JContr Rel，2008，125（3）：193-209.

［2］ Rice-Evans C.Flavonoid antioxidants［J］.Curr Med Chem，2001，8（7）：797-807.

［3］ Lee MJ，Wang CJ，Tsai YY，et al.Inhitory effect of 12-Otetradecanoyphorbol-13-acetate-caused tumor promotion in benzopyrene-initiated CD-1 mouse skin by baicalein［J］.Nutr Cancer，1999，34（2）：185-191.

［4］ 孙涓，余世春.槲皮素的研究进展［J］现代中药研究与实践，2011，5（3）：5-8.