菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum),俗称花蛤，又名蚬子和杂色蛤等，在我国南北海区广泛养殖，是我国养殖的四大经济贝类之一[1].菲律宾蛤仔风味鲜美，营养丰富，其肉体蛋白质含量高，必需氨基酸含量高且种类齐全，同时还含有功能性的成分如牛磺酸、生理活性肽、维生素等[2-4].菲律宾蛤仔提取物还被证实具有抗癌、抗疲劳等功效[5、6].因此，菲律宾蛤仔是一种具有高附加值可开发的贝类.

海洋资源动植物蛋白开发制备高附加值生物产品是现今的研究热点，有学者对贝类、鱼类及其副产物等蛋白综合开发利用进行研究[7-9]，蛋白质水解后生成许多小分子肽和氨基酸，不仅利于人体吸收，提高蛋白质的生物利用率，而且小分子肽具有许多保健功能，因此开发高附加值的产品对提高菲律宾蛤仔的商品价值具有重要意义.

本试验通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对菲律宾蛤仔水解效果、抗氧化性和分子量分布范围的对比研究，筛选最佳的水解酶及其酶解条件，旨在为蛤类的深加工及综合利用提供理论基础，同时也为水解产物制备功能性饮料、调味料等产业化技术开发提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

于2017年5月从福建漳浦养殖场采集新鲜菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum），迅速冰藏后运回实验室，蒸汽开壳取肉后挑选粒度饱满，肉体完整无损，大小均一的新鲜菲律宾蛤仔肉.

木瓜蛋白酶（Papain）和胃蛋白酶（Pepsin）均购自上海生物工程有限公司，DPPH·其他试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器

JFDS-100粉粹机（上海嘉定粮油仪器有限公司）；BS124S分析天平（德国Sartorius）；水浴锅（上海实验仪器有限公司）；TDL-5高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；垂直板电泳装置；凝胶成像分析仪（北京六-WD-9413B型）；脱色摇床等.

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白酶水解液制备的工艺流程 取适量菲律宾蛤仔，清洗干净，然后放入搅拌器搅碎.称量50 g左右的菲律宾蛤仔于100 ml烧杯中，加水50 ml.在前期试验和试剂说明最适条件基础上，用HCl或NaOH溶液调节pH至4.0（胃蛋白酶组）和6.0（木瓜蛋白酶组），再加入胃/木瓜蛋白酶0.5 g，搅拌混匀.马上用保鲜膜将杯口密封，于55℃的电热恒温水浴锅中酶解3 h后，调节温度至100℃恒温灭酶10 min，冷却到室温，3 000 r/min离心10 min，分离水解液.然后将分离出来的样品pH值调至6.0.

1.3.2 酶解液中氨基酸态氮含量的测定 FAAN采用电位滴定法[9]，将酶解液离心后定容、混匀，吸取20 ml加60 ml水.用NaOH标准溶液（0.05 mol/L）滴定至酸度计指示pH 8.2.加入10.0 ml甲醛溶液，混匀.再用NaoH标准滴定溶液继续滴定至pH 9.2，记下消耗NaOH标液的体积V1.空白试验，取80 ml水，先用NaOH溶液调节至pH 8.2.再加入10.0 ml甲醛溶液，再用NaOH标准滴定溶液滴定至pH 9.2，记下消耗NaOH标液的体积V2，则有：

1.3.5 不同分子量活性测定 花蛤原液及酶解液经过20倍稀释后，用不同分子量范围的Millipore离心超滤管 （30、10、3ku）进行离心过滤，过滤后测定不同分子量滤液的氧自由基清除效果.

 

式中X为试样中氨基酸态氮的含量，g/100mL;

V1为测定用试样稀释液加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积，mL;

V2为试剂空白试验加入甲醛后消耗NaOH标液的体积，mL;

C为NaOH标液浓度，mol/L;

[1]路海霞,吴靖娜,许 旻,等.菲律宾蛤仔调味软罐头的工艺研究[J].食品安全质量检测学报,2017,8（4）：1 240-1 247.

用单标线吸管移取适量(见表2)钴产品生产过程CoCl2净化液和Co(NO3)2净化液(Co质量浓度为100～150g/L)于100mL容量瓶中，加入1.00mL Y内标溶液、4.0mL硝酸(1+1)后用水稀释至刻线，混合均匀后制备成待测溶液(保证Co量小于30g/L)，此时样品溶液中Y质量浓度为1.00mg/L。

参考文献：

2010年以来，先后制定出台了山东省主要农作物灌溉定额、山东省重点工业产品取水定额及饮用水生产企业产水率标准等，形成了全省较为完整的用水定额标准体系。严格计划用水管理，将计划用水实施率纳入考核评价体系。出台了《山东省超计划（定额）用水累进加价征收水资源费暂行办法》，对规模以上非农业取用水户，按年度制定用水计划，逐月调度，按季考核，对超计划用水的实行累进加价征收水资源费。

近年来，在国家环保相关政策的推动之下，“节能减排”、“低碳环保”及“绿色工厂”等概念不断被企业所推崇，各种高效节能设备在行业中的利用率也是越来越高。在轨道交通行业，传统的弧焊工艺对工况环境要求恒温恒湿，否则极易出现气孔、夹渣、未熔合等缺陷，同时整个焊接过程会产生大量的烟尘，这不仅对环境造成污染，更是对企业员工身心健康的威胁，企业需要投入大量的资金建设相关除尘排烟设备才可能解决一定的问题。而搅拌摩擦焊对焊接环境要求低，能够实现无烟无尘的绿色焊接。记者在参观忠旺集团车间时发现相关的除尘排烟设备都没有开动，但车间环境依然很好，这也充分证实了搅拌摩擦焊可以作为一种绿色焊接，在企业中投入使用。

在进行旅游开发之前，要先对市场做一个研究，对当地的政策、文化习俗等进行了解。旅游开发应有分工明确的部门管理相应的事务，如卫生、消防、工商等部门。一些旅游开发者没有考虑这些问题，盲目开发，导致生态环境破坏和资源浪费。对旅游市场不健全或没有能力开发的旅游地，应停止开发。

2 结果分析

2.1 胃蛋白酶对菲律宾蛤仔蛋白酶解效果及DPPH·清除的影响

在单因素的基础上，采用胃蛋白酶作用的最佳条件：温度55℃，pH值为4，酶添加量为3%，酶解时间分别为0、1、2、3、4、5 h，3次测定游离氨基态氮和自由基DPPH·清除率的平均值，结果见图1～2

《易经》之中说过：“天行健，君子以自强不息”。天体运行永无休止，君子也要效法天，自强不息。儒家崇尚“学而不厌、诲人不倦”；墨家提倡“非命、尚力”；法家推行“耕战立国、富国强兵”。这些精神都是倡导积极向上、锐意进取的。自强不息的文化精神已经渗入到中华民族的潜意识中，也是中华民族精神的主导精神。

  

图1 胃蛋白酶酶解时间对游离氨基肽氮的影响

  

图2 胃蛋白酶酶解时间对自由基清除率的影响

从图1可以看出，随胃蛋白酶酶解时间的延长，游离氨基酸的含量在逐渐上升，到4 h时游离氨基酸含量最高达到5.5 mg/g；同时对酶解液进行DPPH·测定发现，胃蛋白酶酶解液对DPPH·清除率在2 h时为51.0%，高于其他水解时间.图2可以看出清除率在2 h达到最高后随时间的增加逐步减少，因此说明胃蛋白酶酶解开始时，由于小分子肽的形成，其中具有活性的小分子肽较多，而随酶解时间的增加，具有活性的小分子肽被进一步酶解形成氨基酸.因此采用该酶水解制备活性多肽时，酶解的时间不能过长，否则影响自由基清除效果.

2.2 木瓜蛋白酶对菲律宾蛤仔蛋白酶解效果及DPPH·清除的影响

在单因素的基础上，采用木瓜蛋白酶作用的最佳条件，即温度55℃，pH值为6，酶的添加量为3%，酶解时间分别为1、2、3、4、5 h，3次测定游离氨基态氮和自由基DPPH·清除率的平均值，结果见图3和图4.

2016年以来，一批电子商务平台和电子商务账号慢慢涌现，这类平台或账号具有电子商务属性，以短视频为主要甚至是唯一的呈现手段，吸引消费者实现购买行为。

  

图3 木瓜蛋白酶酶解时间对游离氨基态氮的影响

  

图4 木瓜蛋白酶酶解时间对清除率的影响

2.3 菲律宾蛤仔蛋白酶解SDS电泳

对菲律宾蛤仔及其酶解后的样品进行蛋白电泳（图5），样品1为新鲜菲律宾蛤仔样品，A、B、C分别为木瓜蛋白酶酶解2、3、4 h，D、E、F分别为胃蛋白酶酶解1、2、3 h.从电泳的结果可以看出，样品1的条带多，说明菲律宾蛤仔中蛋白分子量分布范围比较广.经过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解2 h后，小条带基本消失，即小分子蛋白在酶解2 h的时候基本得到较为充分的酶解.木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解液在17 kDa处都呈现同一较浓的条带，表明大分子蛋白酶解后形成一个统一的分子量区，该条带随酶解时间的延长亮度减弱，说明该蛋白在不断酶解成小分子，且胃蛋白酶酶解的2 h时小分子的条带基本没有，木瓜蛋白酶则出现一些未酶解的小条带，在3 h时，两种酶小条带基本消失.这与前期游离氨基酸测定的结果较为一致.

从图3可以看出，随木瓜蛋白酶酶解时间的延长，游离氨基酸的含量在逐渐上升，到5 h时游离氨基酸含量最高达到6.1 mg/g；同时对酶解液进行DPPH·测定发现，木瓜蛋白酶酶解液对DPPH·清除率在3 h时为84.8% （图4），高于2 h和4 h，说明在酶解3 h时具有抗氧化活性的多肽含量高于酶解2 h和4 h，因此用该酶水解时其酶解的时间可以采用3 h，过长时间的酶解同样会影响抗氧化活性肽的生成.同时，本试验也发现，木瓜蛋白酶酶解制备的活性肽酶解液自由基清除率高于胃蛋白酶的.

  

图5 酶解液SDS电泳结果

2.4 不同分子量分布的自由基清除率

对不同分子量范围的菲律宾蛤仔酶解液进行清除率研究结果如表1，从表1可以看出木瓜蛋白酶酶解3 h和胃蛋白酶酶解2 h的酶解液在不同分子量范围清除率不同.2种酶酶解液中分子量小于10 ku的多肽都表现出较强的自由基清除能力.分子量3～10ku和分子量小于3 ku的酶解液自由基清除能力比较接近，说明其在此分子量范围内多肽具有较强的抗氧化能力.

 

表1 不同分子量范围自由基清除率

  

分子量范围/ku自由基清除率/%木瓜蛋白酶酶解3 h 胃蛋白酶酶解2 h＞ 10～30 21 12.2 3～10 30.6 17.6＜3 32.9 18.2

3 结论

菲律宾蛤仔酶解试验表明，各个酶在最适温度、酶解时间和pH值条件下，木瓜蛋白酶酶解菲律宾蛤仔效果最好，胃蛋白酶次之，而在未加蛋白酶的情况下效果最差，这主要与蛋白质的类型有关.蛋白酶按照作用的位点不同可分为内肽酶和端肽酶，内肽酶主要作用蛋白质分子中间的肽键，端肽酶主要作用蛋白质分子的游离氨基或羧基末端，进而逐步降解氨基酸残基.本试验所选用的木瓜蛋白酶是植物来源的蛋白酶和动物源的胃蛋白酶，两种酶都可以使蛋白质水解成游离氨基肽氮，但对于酶解产生活性多肽的能力不同.通过酶解效果和自由基清除效果，采用体外DPPH·抗氧化实验，发现木瓜蛋白酶酶解液在整个酶解过程中抗氧化活性都要高于胃蛋白酶酶解液，结果也表明，并非酶解时间越长酶解抗氧化活性越高，过长时间的酶解会降低酶解液的抗氧化活性.本实验为得到较高的抗氧化酶解液，添加3%木瓜蛋白酶，酶解最佳条件为：温度55℃，时间3h，pH值6.0，此时得到酶解液自由基的清除率最大为84.8%.其主要的抗氧化多肽分子量分布范围为＜3ku和3～10ku.

1.3.3 体外抗氧化DPPH·清除 参照Chen等[10]方法，采用DPPH·(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)方法进行测定.将酶解后的水解液离心后置于250 ml容量瓶中，加水至刻度.稀释到适宜的浓度后取5 mL溶液配成5～100 mg/mL，然后与0.2 m mol/L DPPH·甲醇溶液混合1 min，在暗室内25°C条件下放置30 min，用紫外分光光度计波长517 nm测定吸光度：清除率(%)=[1－(As－Ab)/Ac]×100，其中As为样品组的吸光度，Ab为空白组吸光度 (反应液无DPPH·)，和Ac为对照组 (反应液无样品).测定3次，结果采用平均值.

1.3.4 蛋白凝胶Tricine-SDS-PAGE 电泳为了进一步了解菲律宾蛤仔的水解程度，酶解液经过3 000 r·mim-1离心5 min后采用Tricine-SDS-PAGE进行电泳，电泳方法参照文献[1].

0.014为与1.0 mLNaoH标液相当的氮的质量，g.

[2]KIM E K,HWANG J W,KIM Y S,et al.A novel bioactive peptide derived from enzymatic hydrolysis of Ruditapes philippinarum:Purification and investigation of its free-radical quenching potential[J].Process Biochemistry,2013,48（2）：325-330.

相较于差学生而言，好学生更善于运用各种学习策略来学习词汇，但是调查显示好学生的词汇学习仅局限在课本中。大学英语的教学目标是培养学生的英语应用能力，增强跨文化交际意识和交际能力，同时发展自主学习能力，提高综合文化素养，使他们在学习、生活、社会交往和未来工作中能够有效地使用英语，满足国家、社会、学校和个人发展的需要。[1]教师应该鼓励和引导好学生作一些课外的拓展，适当加深和加大学习的深度和广度，以便更好地学习英语词汇，进而逐步提高英语应用能力。

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针对大一在害怕失败和个人成就维度得分低，以及大二大三大四在该维度得分比较高的特点，应宣扬高年级的积极、阳光的一面，树立良好的形象，带领大一学生的学习、生活各方面的良性发展。而社会取向维度与之对应的是贡献的需要，针对大四在社会取向维度弱的特点，学校应在大一到大三期间充分加强学生的社会责任感的教育，同时也增加社会实践活动，增强对社会的认识，避免在临近实习的大四出现社会取向低、过于功利的情况。

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贾鹏飞因为纵火毁坏他人的财物，已经构成犯罪，被法院判处有期徒刑六年，赔偿胡马强经济损失三十万元。胡马强知道贾鹏飞没有这个赔偿能力，但他恶狠狠地说，牢是要那穷小子坐的！

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