1 引言

毛细管液相色谱作为一种微分离技术,由于其具有操作简单、样品和试剂消耗量小、与质谱联用的相容性好等诸多优点,越来越受到分析研究者的青睐.强阳离子交换是液相色谱中的重要模式之一,广泛应用于药物以及核苷酸、肽链、蛋白质等生物大分子的分离检测[1].因为磺酸基团(-SO3-)在pH<3的强酸条件下仍能保持负电荷,对阳离子具有较强的保留能力,是强阳离子交换柱最常用的功能基团.毛细管整体柱通过在毛细管中原位聚合制备而成.根据整体材料基质的不同,整体柱可以分为无机硅胶整体柱、有机聚合物整体柱和有机与无机杂化整体柱[2].无机硅胶整体柱机械稳定性高,但适用的pH值范围窄,且制备过程复杂,重现性差,通常需要进行后修饰；有机聚合物整体柱制备方法简单,适用的pH值范围宽,但在有机溶剂中存在一定的溶胀性,会对后续色谱分离产生诸多不良影响；有机与无机杂化整体柱在结合了二者各自优点的同时又有效地克服了上述缺陷,因而在毛细管液相色谱中得到了广泛的应用.

本研究利用含有-SO3-基团的3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐(SPMA)为有机功能单体,表面预烯基化的无机纳米硅胶颗粒(直径25～50 nm)为交联剂,通过在150 μm毛细管内原位聚合的方法制备了一种有机与无机杂化强阳离子交换整体柱.利用一组一价无机阳离子和4种核苷酸为测试对象,对该整体柱的色谱分离性能进行了评价.

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Lab Alliance液相色谱泵(美国)；Lab Alliance Model 500紫外-可见光检测器(美国),配自制检测池；SU8010型扫描电子显微镜(SEM,日本日立)；N-2000双通道色谱工作站(浙江大学)；内径150 μm, 外径375 μm石英毛细管(河北永年).

正硅酸四乙酯(纯度≥98%,上海达瑞)；Triton X-100(大连美仑,生化试剂)；3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐(纯度≥98%,阿拉丁试剂)；γ- (甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS,纯度≥95%,武汉凯博)；偶氮二异丁腈(AIBN,化学纯,上海化学试剂)；正己醇、环己醇、甲醇、乙腈、环己烷(纯度 ≥ 99%,分析纯,天津富辰)；实验用水为超纯水；其它无机试剂均为分析纯.

2.2 毛细管预烯基化处理

将内径为150 μm的石英毛细管依次用1.0 M NaOH 溶液、超纯水和1.0 M HCl溶液分别冲洗1 h、0.5 h和1 h,接着用超纯水冲洗至中性,再用甲醇冲洗0.5 h,用氮气吹干.将预烯基化试剂 γ-MAPS与甲醇的混合溶液(体积比1:1)注入毛细管中,密封,置于45℃恒温水浴中反应12 h,最后用甲醇冲洗1 h,氮气吹干,两端密封备用.

整体柱的制备条件(反应温度和时间、单体浓度以及致孔剂的组成等)对整体柱的孔结构、机械稳定性及色谱分离性能有很大的影响.本研究通过优化致孔剂组成比例、单体总浓度、有机功能单体浓度、聚合反应时间等因素,确定了整体柱的最佳制备条件.聚合混合物组成：无机纳米硅胶颗粒(14.4 mg)+SPMA(3.6 mg)+环己醇(22.56 μL)+甲醇(7.52 μL)+水(1.92 μL)+AIBN(0.125 mg)；反应时间,7 h；反应温度,60℃.

就具体策略而言，主要是实现“两化”和“两性”。所谓两化，是指人民调解的“社会化”与“专职化”。所谓两性，是指人民调解的“专业性”与“服务性”。

2.3 二氧化硅纳米颗粒的制备

1)无机阳离子分离.以CuSO4为洗脱液兼间接紫外-可见光检测法的背景吸收液[4],分离和检测了三种常见的一价金属离子(Na+、K+和NH4+).图2考察的是不同盐浓度对色谱分离的影响.当流动相由15 mM CuSO4增大到35 mM CuSO4时,保留时间明显缩短,显示出离子交换机理特征,证明了SPMA参与了聚合物的形成.图3考察的是流速对色谱分离的影响.当流动相流速从0.3 μL/min增加到0.8 μL/min时,被测组分的峰宽无明显变化,柱效损失不大,表明该柱的传质速度较快,固定相的孔隙小且均匀.图4显示,利用较短(2.4 cm)色谱柱可在较短时间(3.5 min)内实现三种阳离子的快速分离,表明该整体柱柱效较高.

2.4 整体柱的制备

在最佳条件下制备了整体柱A(图1A,单体总浓度=36%,纳米硅胶颗粒占100%,SPMA占0%)和整体柱B(图1B,单体总浓度=36%,纳米硅胶颗粒占80%,SPMA占20%).两者的扫描电镜图如图1所示.由图1A可见,在所确定的实验条件下,表面预烯基化的纳米硅胶颗粒之间能够发生聚合反应,形成类似于有机聚合物整体固定相孔结构的连续床,证明了表面预烯基化的纳米硅胶颗粒具有足够的反应活性.对比图1A和B,可以发现,在单体中加入20% SPMA后,聚合物的团簇变小了,相应地孔隙变小、孔径更均匀了.这些变化也表明了SPMA参与了聚合物的形成.

3 结果与讨论

3.1 色谱柱制备

胡马强斜着眼看了胖子一眼，流露出不屑一顾的神情。最后他说，何泽，看在我们合作两年多的面子上，给你十八万算了，多一分钱拉倒。

3.2 整体柱的孔结构

配制A、B、C3种溶液.A为三元致孔剂混合液(水、甲醇和环己醇的体积比为1:4:12),B是用A溶液配制的浓度为12%的SPMA溶液,C是用A溶液配制的浓度为2.5%的AIBN溶液.3份溶液均需通入N2并超声振荡至澄清状态.取一个1.5 mL的离心管,称取14.4 mg表面预烯基化的纳米硅胶颗粒至离心管中,加入30 μL B溶液,0.6 μL A溶液,通入N2并超声振荡1 min,加入5 μL C溶液,通入N2并超声振荡30 s后制得均匀混合物.迅速用注射器将聚合反应混合物注入预处理的毛细管中,将毛细管两端密封,置于60℃恒温水浴中反应7 h,用大于50倍柱体积的甲醇冲洗整体柱.最终制得有机与无机杂化强阳离子交换整体柱.

3.3 色谱分离

采用文献[3]报道的油包水反相微乳液法合成二氧化硅纳米颗粒.具体方法如下：将7.5 mL环己烷、1.6 mL正己醇和1.8 mL表面活性剂Triton X-100混合,搅拌5 min至澄清,加入1.07 mL超纯水作为分散相,常温下搅拌30 min,形成透明且稳定的油包水微乳液.将100 μL的反应前体正硅酸乙酯(TEOS)和100 μL催化剂氨水加入到微乳液体系中,连续搅拌24 h,用无水乙醇破乳,18000 r/min离心15 min,收集硅胶纳米颗粒.收集的二氧化硅颗粒用无水乙醇洗两次,超纯水洗一次.按照文献[3]的报道,在此条件下制备的二氧化硅纳米颗粒直径在25～50 nm之间.将二氧化硅纳米颗粒表面进行预烯基化处理,具体方法参照毛细管内壁预烯基化处理.

图1 扫描电镜图

A. 15 mM CuSO4 B. 25 mM CuSO4 C. 35 mM CuSO4

图2 流动相离子强度对分离的影响

实验条件：有效柱长5.5 cm；流速0.45 μL/min；CuSO4浓度依次为(A) 15 mM (B) 25 mM (C) 35 mM；紫外检测波长210 nm. 组分：1. Na+；2. NH4+；3. K+.

D. 0.3 μL/min E. 0.5 μL/min F. 0.8 μL/min

图3 流动相流速对分离的影响

实验条件：有效柱长2.4 cm；流动相50 mM CuSO4；流速0.5 μL/min；紫外检测波长210 nm. 组分：1. Na+；2. NH4+；3. K+

图4 三种阳离子的快速分离

实验条件：有效柱长5.5 cm；流动相20 mM CuSO4；流速分别为(D) 0.3 μL/min (E) 0.5 μL/min (F) 0.8 μL/min；紫外检测波长210 nm. 组分：1. Na+；2. NH4+；3. K+.

2)核苷酸分离.以磷酸盐缓冲溶液为流动相,以乙腈为有机添加剂,在pH=2.5条件下分离了腺苷酸(AMP)、胞苷酸(CMP)、鸟苷酸(GMP)和尿苷酸(UMP)4种核苷酸.根据这4种核苷酸的解离常数(见表1),在pH=2.5流动相中,UMP和GMP不带电荷,AMP和CMP不同程度地带有正电荷.图5考察的是磷酸盐浓度和有机添加剂对色谱分离的影响.通过比较图5(B)和(C)可以发现,当NaH2PO4浓度从5 mM降低到1 mM时,核苷酸保留时间均有所增加,带正电荷的CMP和AMP的保留时间延长尤为明显,显示出离子交换作用机理的特征.通过比较图5(A)和(B)可以发现,当流动相中加入15%ACN时,所有的核苷酸保留时间均增加,显示了该柱的亲水性特征.所以,这4种核苷酸在该整体柱上的分离是离子交换和亲水机理混合作用的结果.此外,值得注意的是,该整体柱对带正电荷的CMP和AMP具有较强的保留能力,表明离子交换机理对这4种核苷酸的分离起主导作用.

2.发展思路：深入挖掘黄河口文化内涵。黄河口文化是黄河文化、齐鲁文化等多元文化在黄河入海口区域碰撞、汇聚、融合所形成的一种独具特色的地域文化形态，是一种具有母亲河归结处象征性的文化，内容体现为有史以来生活在这一地域的人民群众共同创造的反映其思维水平的精神风貌、生产生活类型、社会结构模式、风俗习惯特征、文化心理心态的总和，其核心要素体现为其本身所蕴涵的华夏各族人民的凝聚力、向心力和自信心等价值形态［8］。因此应深入挖掘黄河口文化内涵，把握其产生、发展、形成的轨迹，分析其地域特征，探索文化优势多层次、多方式向产业化转化的途径。

表1 核苷酸解离常数

核苷酸第一磷酸基第二磷酸基氨基pKa1pKa2pKa3尿苷酸1.06.4/鸟苷酸0.76.12.4腺苷酸0.96.23.7胞苷酸0.86.34.5

图5 磷酸盐浓度和有机添加剂对色谱分离的影响

4 结论

利用含有-SO3-基团的3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐(SPMA)为有机功能单体,表面预烯基化的无机纳米硅胶颗粒为交联剂,通过在毛细管内原位聚合的方法制备了一种新型有机与无机杂化强阳离子交换整体柱.确定了整体柱的制备条件.该整体柱具有制备方法简单、固定相孔隙小且均匀等显著特点.利用该整体柱,基于离子交换机理分离了一组一价无机金属阳离子,基于离子交换机理和亲水相互作用分离了一组核苷酸.

其次是建立声学模型。在所有的Kaldi的测试运行中，使用预定义培训脚本，这些脚本仅针对输入数据进行了调整。在测试运行中，在实验语料库中使用具有LDA+MLLT+SAT+fMLLR的GMM模型之上的DNN。

参考文献:

[1] Couchman L,Morgan P E,Flanagan R J.Basic drug analysis by strong cation-exchange liquid chromatography-tandem mass spectrometry:simultaneous analysis of amisulpride,and of metamfetamine and amphetamine in serum/plasma[J].Biomedical Chromatography Bmc,2011,25(8):867-872.

[2] Aggarwal P,Tolley H D,Lee M L.Monolithic bed structure for capillary liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A.，2012,1219(2):1-14.

[3] Bagwe R P,Yang C,L R H,et al.Optimization of dye-doped silica nanoparticles prepared using a reverse microemulsion method [J].Langmuir,2004,20(19): 8336-8342.

[4] Ueki Y, Umemura T,Li J,et al.Preparation and application of methacrylate-based cation-exchange monolithic columns for capillary ion chromatography[J].Analytical Chemistry,2004,76(23):7007-7012.