DNA是动植物的基本遗传物质，是遗传信息的载体。高质量的DNA样品是进行PCR扩增、分子杂交、遗传多样性分析及基因组学等分子生物学研究的基础[1]。现阶段，以纯化的DNA分子形式或基因组文库的方式进行遗传物质保存是对传统资源保存方式的重要补充之一[2]，因此，DNA的提取质量直接影响到后续试验的成败，获得高质高量的DNA对实现资源保存显得尤为重要。关于猕猴桃属植物的DNA提取方法较多[3-8]，在进行提取时虽然能得到一定质量的DNA，但常含有多糖、多酚等杂质，对后续试验有一定影响，为节省试验时间，获得高质量DNA，所以本试验将探究以不同试验方法对猕猴桃属植物DNA提取效果和提取质量进行比较分析确定哪种方法更适用于猕猴桃属植物DNA的提取。本试验以四种猕猴桃幼嫩叶片为材料，采用5种不同方法进行试验对比，通过紫外分光光度计与琼脂糖凝胶电泳对所提取样品的DNA质量进行检测，以期找到快速、高效的DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在贵阳学院生物与环境工程学院实验室进行。以六盘水市水城县猕猴桃实验基地4份猕猴桃属植物的叶片为试材：软枣猕猴桃(Actinidia arguta)、葛枣猕猴桃( Actinidia polygama)、贵长猕猴桃(Guichang kiwifruit)、红阳猕猴桃(Hongyang kiwifruit)。取健康植株一年生枝条上的嫩叶，洗净、吸水纸吸干后，置于冰盒内带回实验室，经液氮处理后放置-80℃冰箱中保存备用。

1.2 试剂和仪器

实验中主要药品：聚乙稀吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris-HCl、Marker、β-巯基乙醇、氯仿、异丙醇、异戊醇、无水乙醇、核酸染料、乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钠、山梨醇、百泰克试剂盒、天根试剂盒等均为进口或国产分析纯级产品，购自上海生物工程技术服务有限公司、贵阳恒因生物科技有限公司和北京百泰克生物科技有限公司和天根生化科技(北京)有限公司。

主要仪器设备：Applied Bio-Systems PCR扩增仪、移液器(德国Eppendorf产品)、-20℃冰箱(海尔 BCD-206TS DZ)、-80℃冰箱(ULTRA ATUOMATIC FLAKE ICE MARKER U410)制冰机(IMS-20)、纯水仪(艾柯 AKSW-24)、常温离心机(D-37520 OSTERODE)、K5500 微量分光光度计、电泳仪(Bio-RAD POWER SUPPLY)、BIO-RAD凝胶成像系统、HH-2数显恒温水浴锅。

1.3 试验方法

1.3.1 传统CTAB法

由表1可以看出，传统CTAB法提取对几种样品提取时间较长，约为7小时左右，提取液均较粘稠或粘稠，红阳猕猴桃抽提后蛋白质层较厚，TE溶解较难，OD值为2.15，可能红阳猕猴桃叶片含有蛋白质较高，其他杂质也较多；改良CTAB法时间要较传统方法长1个小时，提取液因经过山梨醇洗液漂洗过一次，所以提取液均不粘稠，蛋白质层较少，除红阳猕猴桃外，其他均易溶于TE，OD值也是红阳猕猴桃较低，说明含有小分子物质的杂质；简易CTAB法因省略后续再次抽提步骤，所以时间要减少2小时，提取液也较粘稠或粘稠，红阳猕猴桃抽提后蛋白质层较厚，TE溶解较难，OD值均低于1.70，说明都含有小分子物质的杂质；百泰克试剂法与天根试剂盒法用时均较短，约2小时就能完成所有步骤，而且在抽提过程中提取液不粘稠，易溶于TE，OD值和浓度均达到后续PCR标准。

1.3.2 改良CTAB法[12]

在传统方法第一次析出DNA后，风干后的DNA离心管中加入4μLRNA酶以及200μLTE，在37℃下处理半小时后保存至零下20℃冰箱中。

1.3.3 简易CTAB法

在传统方法加入CTAB之前加入山梨醇溶液进行漂洗，山梨醇溶液1200μL，PVP60μL(现用现加)，β-巯基乙醇60μL(现用现加)，摇匀配平离心3000r/min 3min，离心完毕倒地上清液。后续与传统方法步骤一致。

除了美国、加拿大，世界上还有埃及、希腊等国家有自己独特的感恩节，但英国、法国等欧洲国家却与感恩节绝缘，也有学者倡议设立“中华感恩节”，以弘扬传统文化。

教师或楼管员到达系统图像识别区域时，高清摄像头会对其面部进行图像拍摄，图片将会被传输到系统内部，并对其进行人脸检测与识别。系统集成云日志、RFID双层验证、手机管理认证等一系列安全保障机制，以进一步加强系统的安全性。图2为人脸识别工作原理图。

参照百泰克植物DNA提取试剂盒方法。(引自植物基因组DNA提取百泰克试剂盒)

1.3.5 天根试剂盒法

参照天根植物DNA提取试剂盒方法。(引自天根试剂盒)

1.4.1 OD值及浓度的测定

1.4 DNA质量检测

在微环谐振腔系统中,耦合区域为直波导-弯曲波导的耦合方式(直-弯侧向耦合),如图4所示,其中,a为波导宽度,d为耦合间距,k为耦合系数,耦合长度为2L。

2）系统的兼容性有待提高。系统的设计按照项目管理的基本程序来进行，因此对于历史项目和数据不能很好地兼容。如按照项目申报—中期检查—项目结题的程序，只有使用系统进行申报的教改项目才能使用系统进行中期检查等后续各项管理工作，以往的项目只能沿用以往纸质形式，一定程度上影响了系统的使用效率。

用K5500型超微量分光光度计分析仪进行DNA样品质量和浓度的检测，取溶解DNA的TE1μL于超微量分光光度计上作对照校零，取1μL的DNA溶液进行测定，读取OD260/OD280比值，为DNA样品的OD值；读取样品的浓度。

1.3.4 百泰克试剂盒法

本试验中采用的传统CTAB法缓冲液与β-巯基乙醇、PVP是分开加入离心管中，β-巯基乙醇作为一种强还原剂，通常可用于保护DNA免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等物质的损害，防止酚氧化，PVP是一种酚的络合物，可与酚类物质结合，有效地抑制酚类物质的氧化，从而减少酚类物质的含量，起到纯化作用[14]。但此方法对于大批量以及高质量提取植物DNA暴露出很大的缺点，耗时太长且过程中容易受到外界的影响。

每一样品取5μL(加入2μL核酸染料)于1%的琼脂糖凝胶上电泳，设置电压100V，40min。λDNA/EcoRI+HindIII为Marker以检测DNA的质量。

2 结果分析

2.1 不同猕猴桃对不同方法的电泳结果

从图1中可以看出，这五种方法对贵长猕猴桃都是适用的，都有DNA条带的出现，条带长度大约在21000bp左右，传统CTAB法、改良CTAB法条带较弱，杂质残留不明显，简易CTAB法条带较亮，但有蛋白质、RNA残留，百泰克法与天根试剂盒法都较亮，百泰克有RNA残留，天根试剂盒法更亮一些，且没有RNA残留。

同一种方法对不同的品种可以看出，各品种均有DNA条带出现，葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃与贵长猕猴桃情况基本一致，红阳猕猴桃传统CTAB方法没有条带，改良与简易CTAB法有条带但较弱，简易CTAB法有RNA残留，百泰克试剂盒法条带较弱，有RNA残留，天根试剂盒法条带较亮，无杂质残留。

 

(第一行泳道1为Marker， 2-6泳道为：贵长猕猴桃的五种方法，7-11泳道为：葛枣猕猴桃的五种方法，第二行泳道1为Marker， 2-6泳道为：红阳猕猴桃的五种方法，7-11泳道为：软枣猕猴桃的五种方法)

图1 不同猕猴桃对不同方法的电泳条带图谱Fig.1 Electrophoretic bands of different methods of different kiwifruit

2.2 猕猴桃DNA OD值测定结果

参考CTAB法[9]。

 

表1 五种方法提取猕猴桃DNA OD值Tab.1 The five methods for extracting kiwifruit DNA OD

  

编号 Number提取时间(小时)提取液粘稠度氯仿抽提后的离心表现TEOD值/(OD260/280)浓度/(ng·μl-1)传统CTAB法贵长猕猴桃7较粘稠蛋白质层较少易溶1.78111.45葛枣猕猴桃7较粘稠蛋白质层较少易溶1.8143.45红阳猕猴桃7粘稠蛋白质层较厚不易溶2.15189.86软枣猕猴桃7较粘稠蛋白质层较少易溶1.64115.47简易CTAB法贵长猕猴桃5较粘稠蛋白质层较少易溶1.6850.35葛枣猕猴桃5较粘稠蛋白质层较少易溶1.6147.65红阳猕猴桃5粘稠蛋白质层较厚不易溶1.5547.90软枣猕猴桃5较粘稠蛋白质层较少易溶1.6747.81改良CTAB法贵长猕猴桃8不粘稠蛋白质层较少易溶1.9778.72葛枣猕猴桃8不粘稠蛋白质层较少易溶1.9673.65红阳猕猴桃8不粘稠蛋白质层较少不易溶1.5147.15软枣猕猴桃8不粘稠蛋白质层较少易溶1.8427.19百泰克试剂盒法贵长猕猴桃2不粘稠无易溶1.69317.11葛枣猕猴桃2不粘稠无易溶1.9660.12红阳猕猴桃2较粘稠无易溶1.9635.42软枣猕猴桃2不粘稠无易溶1.8983.55天根试剂盒法贵长猕猴桃2不粘稠无易溶1.74400.23葛枣猕猴桃2不粘稠无易溶1.9640.89红阳猕猴桃2不粘稠无易溶1.9618.17软枣猕猴桃2不粘稠无易溶1.9722.46

3 讨论

3.1 五种DNA提取方法比较

1.4.2 DNA的电泳检测

若继受取得说成立，依其定义必须从他人处通过让渡取得权利，这里所指的他人，只能是善意取得关系人中的原权利人或无权处分人，权利只能从原权利人或无权处分人处让渡。

采用改良CTAB法以及简易CTAB法是在传统CTAB法方法步骤基础上进行改进，改良CTAB法在传统方法加入CTAB之前加入山梨醇溶液，作用是洗脱猕猴桃叶片中的多余的糖分和多酚类物质，但此方法不仅在传统CTAB法上加了一步耗时过长，而且试验分析发现采用此法提取效果一般。简易CTAB法在传统方法第一次析出DNA风干后的DNA离心管中加入4μLRNA酶以及200μLTE随后保存至零下20℃冰箱中。此法在原方法基础上大大缩短了耗时，对于批量提取植物DNA有所改进，但经过试验分析得知采用此法未提取出DNA或提取的DNA中含有较多RNA残留以及颜色污染，这可能是由于未经过传统CTAB法中最后抽提洗脱步骤的原因[15]。

(3)根据精度要求对[0,2π)进行角度区间分割,对所有的P(xP,yP)∈U,计算与x轴的夹角,记录P所属的区间,并对其所在区间进行投票;

综上，现代社会发展对公共事务管理工作提出了更高要求，因此行政事业单位需要重视起自身职能发挥，并做好内部控制工作，为外部服务和管理提供有效保障。会计内部控制工作是行政事业单位的重要内控手段，基于此，我们需要强化会计内部控制意识，完善和落实会计内部控制工作力度，提升会计内部控制工作有效性。本研究中笔者试分析行政事业单位会计内部控制工作中存在的问题和相应的解决措施，以期促进行政事业单位的正常运行和社会主义经济发展。

试剂盒A法(百泰克)、试剂盒B法(天根)相较于前三种方法具有明显的优势。首先方法步骤简易适宜大批量提取要求，其次提取所用的药品为标准化产品能保证一定的质量。经过试验分析得知上述两种方法提取的DNA质量优于采用CTAB法，但在提取的质量上试剂盒A法有杂质残留现象，而试剂盒B法提取的效果优于试剂盒A法，在更省时的基础上又能获得高质量的DNA，综上所述试剂盒B法更适用与猕猴桃属植物DNA的提取。

3.2 不同种之间DNA提取的难易比较

由试验分析得知，不同种的猕猴桃即便用相同的提取方法得到的DNA在质量上也是不尽相同的，说明不同种之间的猕猴桃在提取的难易程度上是不同的。这是因为不同种的猕猴桃中含有的多酚、糖类物质的量有差别，在试验时发现红阳、贵长、葛枣猕猴桃由于富含多糖及多酚类物质[7]在提取时往往会出现杂质影响操作，特别是在析出的时候不易于DNA分离导致提取的质量不高。而软枣猕猴桃在同种提取方法下比其余三种猕猴桃好提取，对于后续的实验也能拿出准确的数据。

经过本试验明确了对于猕猴桃提取的相对比较适用的方法，这也为后续大批量提取及PCR实验分析物种多样性做出铺垫。

参考文献：

[1]周世良,李金璐,于婧,等.一种提取植物DNA 的方法及其专用试剂盒:CN,CN102643800 B [P].2014.

[2]曾英,付小莉,王浩鑫.宏基因组文库的保存和筛选方法:CN201010297594.9 [P].2011-02-09.

[3]陶爱丽,文祯中,阚云超,等.美味猕猴桃基因组DNA的提取条件优化[J].南阳师范学院学报(自然科学版),2004,9(3):56- 58.

[4]丁建,董晓莉,郑晓琴,等.一种简便高效提取猕猴桃DNA的方法[J].资源开发与市场,2006,22(5):401- 402.

[5]李思光,罗玉萍,陈万秋,等.猕猴桃基因组DNA的提取及其RAPD扩增研究[J].南昌大学学报(理科版),2001,25(3):264-268.

[6]徐小彪,陈华,张秋明.美味猕猴桃基因组DNA的高效提取[J].中国农学通报,2004,20(4):43-53.

[7]陈华,徐小彪,易干军,等.猕猴桃基因组DNA不同提取方法的研究[J].江西农业大学学报,2005,27(1):12- 16.

[8]林智华,林程忠,梁红,等.猕猴桃基因组DNA提取的研究[J].安徽农业科学,2009,37(3):996-998.

[9]C.Neal Stewart,Jr.,Laura E.Via.A Rapid CTAB DNA Isolation Technique Useful for RAPD Fingerprinting and Other PCR Applications[J].BioTechniques,1993,14(5):748-749.

[10]魏艳霞,豁泽春,王飞,等.野生猕猴桃DNA的提取及RAPD分析体系的建立[J].西北农业学报,2008,17(2):169-173.

[11]袁云香,王志平.猕猴桃基因组DNA提取方法的研究进展[J].北方园艺,2011(8):195-197.

[12]陈昆松,李方,徐昌杰,等.改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取[J].遗传,2004,26(4):529-531.

[13]陈万秋,李思光,罗玉萍,等.猕猴桃模板DNA的提取及RAPD—PCR最佳反应体系的建立[J].生物技术通报,2003(3):40-43.

[14王卓伟，余茂德，鲁成.PVP在桑叶总DNA提取中的应用[J].西南农业大学学报,2001,23(1):61-62.

[15]胡凤荣,任翠,鲍仁蕾,等.风信子DNA不同提取方法的效果比较[J].沈阳农业大学学报,2011,42(5):570-573.