胃癌是常见的严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，全球每年约有100万新发病例及50万死亡病例，是一种较为常见的实体肿瘤。影响胃癌疗效和死亡的主要原因是转移[1]。临床上很多胃癌患者在根治性手术前已有微转移，这是术后转移和复发的直接原因。探讨与胃癌转移相关的因素，阐明转移机制以期控制转移，寻找预防和治疗胃癌的有效途径，是当前研究的重要方向。

鉴于上皮间质转化(EMT)的标志物上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)在促进胃癌转移和侵袭中的作用，因此检测转移过程中三者的表达水平，探索其作为预测胃癌转移的早期诊断工具将具有重要的临床意义，同时检测EMT标志物在原发性胃癌组织中的表达，了解EMT在胃癌血行转移中的基因表达变化，从而为胃癌的转移机制研究作初步的探索。

1 材料与方法

1.1 材料

SGC-7901胃癌细胞购于中国科学院上海细胞库。4～6周龄BALB/c-nude雌性裸鼠10只，平均体质量18～20 g，购自中国科学院上海斯莱克实验动物中心。所有抗体均购自美国Calbiochem公司。免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。所有RT-qPCR引物由上海生工公司合成。二抗鼠抗兔抗体购自北京中山生物技术有限公司。循环肿瘤细胞(CTC)细胞提取磁珠CELLectionTM Epithelial Enrich试剂盒购自Life technologies，单细胞mRNA反转录试剂盒Single cell-to-Ct购自Ambion，RT-qPCR试剂盒SsoAdvanced SYBR Green Supermix购自Biorad。

世行项目的实施，改善了项目区农业基础设施，调整了土地利用结构，提高了土地生产率，减轻了自然灾害，促进了致富奔小康、村容村貌改变和生态文明建设。机耕道达村组，人行便道连院户，极大地方便农民出行；自来水进农户，解决了农村饮水困难；通过沼气建设，项目区农民用上了清洁生活能源，替代煤炭、薪柴和秸秆，保护植被资源，同时，沼渣、沼液作为优质有机肥还田，减少农药、化肥施用量，提高了农产品品质。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及动物饲养 SGC-7901胃癌细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。裸鼠均在无特殊病原菌(SPF)条件下分笼饲养。

CGF还具有良好的纤维蛋白结构。通过Medifuge分离处理后的CGF，能够获得结构为三维聚合物的网络式纤维蛋白。依赖于这种富有弹性、结构疏松并且纤薄的网状纤维蛋白，生长因子诱导组织修复与再生过程中有了一个可靠的支架，可以使得大量干细胞在支架上附着并进行增殖与分化[6]。

1.2.5 免疫组织化学检测原位胃癌中EMT相关因子的表达 分离得到的肿瘤组织包埋、固定、石蜡切片、脱蜡，3%H2O2 室温孵育30 min，热修复抗原，滴加正常山羊封闭液封闭，加入一抗兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin单克隆抗体，湿盒4 ℃冰箱中过夜，次日加入二抗鼠抗兔抗体，湿盒中37 ℃、30 min、DAB显色，常规乙醇梯度脱水、透明、封片，显微镜观察并记录。阳性反应为胞质内出现棕黄色颗粒。

未来机构，Enami将同智利国家铜业公司(Codelco)证实宣布合资开发厄瓜多尔最大铜矿之一的鲁里马瓜(Llurimagua)项目，Codelco已经投资4 000万美元勘查该项目。截止到目前，已探明矿石资源量3.18亿t，铜品位0.7%贝纳尔卡萨表示，欢迎所有大型矿业公司前来投资，但前提是必须遵守环境管理规定。

与原位胃癌组织比较，E-cadherin在CTC与SGC7901细胞中表达水平降低，F=11.739，P<0.05，差异具有统计学意义。与原位胃癌组织比较，N-cadherin在CTC与SGC7901细胞中表达水平升高，F=18.947， P<0.05，差异具有统计学意义。与原位胃癌组织比较，Vimentin在CTC与SGC7901细胞中表达水平升高，F=16.574， P<0.05，差异具有统计学意义。见图2，表2。

 

表1 RT-qPCR引物模板

  

基因类型 引物序列GAPDHSense5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3'Anti-sense5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'E-cadherinSense5'-AAGGCACAGCCTGTCGAAGCA-3'Anti-sense5'-ACGTTGTCCCGGGTGTCATCCT-3'N-cadherinSense5'-TGCGCGTGAAGGTTTGCCAGT-3'Anti-sense5'-TGGCGTTCTTTATCCCGGCGT-3'VimentinSense5'-ACCGCACACAGCAAGGCGAT-3'Anti-sense5'-CGATTGAGGGCTCCTAGCGGTT-3'

1.2.3 通过裸鼠眼眶血富集CTC 于造模后第8周从裸鼠眼眶静脉丛采血。每次每只采血量为0.2 ～0.3 mL。通过免疫磁珠富集法收集CTC富集液，将筛选的细胞液在显微平台下进行形态学筛选，筛选标准：(1) 细胞呈圆形、椭圆形或长形，长径>10 μm；(2)光镜下可见完整细胞形态及细胞核；(3)核浆比失常。将选定的CTC在单细胞挑取台上细针挑取收集，以备单细胞RT-qPCR分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐者采用最小显著差异(LSD)方法，方差不齐者采用DunnettT3法，检验水准P<0.05。

2 结果

2.1 原位胃癌转移情况及CTC计数

建筑工程电气安装工程涉及到的管线敷设非常多，确保建筑电气安装工程管线敷设的质量，需要注意以下方面的质量控制要点：

1.2.2 裸鼠原位瘤模型的构建 取处于对数生长期的SGC-7901细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×108 /mL。用注射器在每只裸鼠(共2只裸鼠)右侧肩胛部皮下注射细胞悬液0.l mL，注射后轻压5 s，2周后右侧肩胛部皮下出现米粒大小质硬结节为模型建立成功。以颈椎脱臼法处死，剥取移植瘤，在培养液中分割成1 mm×1 mm的组织碎块。接下来建立原位胃癌移植模型，共10只裸鼠。诱导麻醉后，暴露腹腔组织，用生物胶将1块胃癌组织粘在裸鼠胃组织上。整个操作过程在超净工作台中完成。之后每天观察裸鼠状态，测量裸鼠体重。8周后，当裸鼠出现恶病质(表现为消瘦，腹水及精神萎靡)时处死所有裸鼠，剖腹观察并统计原发肿瘤大小，转移灶位置及个数，同时对原发肿瘤进行称重。分离转移瘤及原发灶，放入10%福尔马林中固定，用于免疫组织化学检测。另取部分原发灶肿瘤组织保存于液氮罐中，用于RT-qPCR的检测。

1.2.4 RT-qPCR检测EMT相关因子表达水平 收集后的CTC行单细胞RT-qPCR ，检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin。Single cell-to-Ct试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，并以E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及GAPDH对应引物进行预扩增。预扩增后产物2 uL加入25 uL含对应引物的SsoAdvanced SYBR Green Supermix进行qPCR，采用SYBR green荧光标记法检测PCR产物。检测各基因表达水平，以GAPDH为内参照。RT-qPCR结果采用仪器自带软件分析，根据标准曲线计算基因拷贝数。记录各实验组荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数即Ct值，以GAPDH为内参，计算目的RNA的相对表达量(2-ΔΔCt)。SGC7901细胞及胃癌组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表达水平检测同上所述。所有引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物的设计根据Genbank的基因序列、用Primer 5.0软件设计，引物序列见表1。

  

图1 裸鼠原位移植胃癌腹腔转移情况 A 原位移植胃癌 B 原位移植胃癌肝脏转移 C 原位移植胃癌横隔转移

2.2 EMT相关因子表达水平

利用无人机进行工程测量时，需要考虑在山地、矿区和丛林等特殊的环境条件下使用的效果。在工程测量范围内，应对无人机进行合理的升降设置，设置滑翔距离，使其能够顺利完成起飞。对于大型无人机而言，当不能满足其起飞的条件时，需结合自然环境适当调节起飞的高度，提高对风力的抵抗能力，并有效防止因山间大风的干扰造成无人机坠毁。另外，运用无人机测绘技术还需考虑无人机重量、机械设备的外形等会影响起飞状态的因素，再结合实际情况调整无人机机械设备的参数，以便提高操作过程中的安全性，并满足工程测绘过程中的测量需求。

在观察过程中，共有3只裸鼠死亡，其余裸鼠均顺利在第8周采集CTC后处死。所有裸鼠均可在外周血中采集到CTC，平均每只15.78个。如图1所示，裸鼠原位移植胃癌在体内广泛转移，肝脏，腹膜，淋巴结及肠系膜均可以发现转移灶。

 

图2 SGC7901细胞、CTC及原位胃癌组织中EMT相关因子表达水平

 

表2 EMT相关因子表达水平的差异

  

SGC7901原位胃癌组织CTCFPE-cadherin0.462±0.0370.893±0.0130.293±0.07611.739 <0.05N-cadherin0.764±0.0280.274±0.0220.872±0.01718.947<0.05Vimentin0.824±0.0530.301±0.0340.914±0.06416.574<0.05

2.3 原位胃癌中EMT相关因子表达水平

免疫组化结果显示，E-cadherin在原位胃癌中表达呈强阳性，N-cadherin、Vimentin在原位胃癌中表达呈弱阳性，且主要集中在细胞膜。见图3。

  

图3 原位胃癌中EMT相关因子表达水平(免疫组织化学 ×200) A E-cadherin B N-cadherin C Vimentin

3 讨论

在中国，胃癌是一种发病率高、恶性程度高、预后不良的恶性肿瘤。长期以来, 临床手术切除及辅助性放射治疗、化学治疗技术的应用并没有达到满意的生存率。

近年来研究表明，肿瘤在发生转移前，原发灶肿瘤细胞通常会在其微环境的影响下经历EMT的改变。在EMT过程中，上皮细胞失去极性，与周围细胞接触减少，细胞间连接被破坏，细胞内肌动蛋白骨架重组，表现为细胞角蛋白下调和波形蛋白上调[2]。这一系列改变使得细胞黏附能力下降，运动能力增加。此外，EMT过程还分泌大量基质金属蛋白酶(MMP)，其作用于细胞外基质，从而使肿瘤细胞更易离开所在部位和游走，进而向邻近组织侵袭或进入血管并向远处转移[3]。发生EMT的肿瘤细胞被赋予干细胞特性，细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强，脱离原发灶后进入血液形成CTC。因此，EMT是CTC形成的关键步骤。CTC已被认为是导致肿瘤远处转移的主要根源[4]。肿瘤细胞发生EMT，除了可促进CTC产生外，还可促进CTC存活，并且进一步促进CTC形成肿瘤转移灶[5-6]。有研究报道，将转染Slug或Snail(调节EMT的转录因子)的肿瘤细胞接种至免疫功能低下的小鼠皮下，可见肿瘤血管密度明显增加。Snail还可诱导上皮细胞表达血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，促进血管生成[7]。此外，研究还发现调节EMT的主要转录因子ZEB-1可增强前列腺癌细胞PC-3与内皮细胞之间的相互作用，有助于肿瘤细胞内渗，从而使其进入循环系统，最终形成CTC[8]。Mani等[9]和Barrière等[10]研究发现，发生EMT的乳腺癌细胞除具有干细胞的部分特性(如自我更新等)外，还获得了抗凋亡能力。目前认为，发生EMT的细胞不仅转移和侵袭能力增加，而且抵抗凋亡和衰老，从而有助于细胞扩散、存活以及在远隔器官处生长，形成转移灶[11]。本研究结果显示EMT确实参与胃癌细胞体内转移过程，当胃癌细胞处于活动状态时，迁移和侵袭能力增强，N-cadherin、Vimentin表达水平升高，而胃癌细胞处于相对静止状态，如原位胃癌组织中，E-cadherin表达水平升高。

因此，通过抑制肿瘤细胞发生EMT，防止CTC产生，则有可能阻止肿瘤转移与复发。阻断甚至逆转EMT过程将成为临床上对抗肿瘤进展的一个新策略。比如，鉴于N-cadherin表达是EMT现象的特征之一，有研究将N-cadherin抑制剂ADH-1作为化学治疗辅助用药，发现其可以增强黑素瘤细胞对化学治疗药物melphalan的敏感性[12]。预测使用EMT抑制性药物联合靶向治疗或传统放射治疗将会成为未来治疗肿瘤和防治转移的一个重要方向。鉴于EMT在肿瘤细胞从原发灶迁移到循环系统或淋巴系统中扮演的特定角色，可阻断EMT相关的众多因子或者通过探索新的调节因子，不仅有助于更好地阐明EMT与肿瘤的关系，而且为肿瘤发生发展机制的研究和治疗提供新的思路和方法。

参 考 文 献

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2 Felipe Lima J, Nofech-Mozes S, Bayani J, et al. EMT in Breast Carcinoma-A Review[J]. J Clinl med, 2016, 5(7). pii: E65.

3 Li W, Li S, Deng L, et al. Decreased MT1-MMP in gastric cancer suppressed cell migration and invasion via regulating MMPs and EMT[J]. Tumour Biol, 2015, 36(9): 6883-6889.

4 Polioudaki H, Agelaki S, Chiotaki R, et al. Variable expression levels of keratin and vimentin reveal differential EMT status of circulating tumor cells and correlation with clinical characteristics and outcome of patients with metastatic breast cancer[J]. BMC Cancer, 2015, 15: 399.

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