甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)是一种小分子抗肿瘤药物,属于酪氨酸激酶抑制剂,结构见图1,是目前治疗慢性粒细胞白血病地首选药[1]。在甲磺酸伊马替尼合成最后一步伊马替尼与甲磺酸反应,在此过程中甲磺酸可能与用到的溶剂甲醇、乙醇或异丙醇反应,生成甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)或甲磺酸异丙酯(IMS)[2],除此之外,甲磺酸本身可能含有MMS、EMS或IMS,而带到目标药物中。这些甲磺酸烷基酯属于基因毒性杂质,具有致癌、致畸、致突变等作用[3]。

Study on the design strategy of water environment protection and development in Lake Village, Jixi County, Anhui

  

图1 甲磺酸伊马替尼的结构Fig.1 Chemical Structure of Imatinib Mesylate

近年来,甲磺酸烷基酯类基因毒性杂质越来越多地受到各方的关注和重视,尤其是欧盟方面。早在2000年,欧洲药典论坛上便发表了一篇文章[4],提到甲磺酸盐药物成盐过程中有形成甲磺酸烷基酯的风险,因此有必要对其进行风险评估和限量控制。2007年 “维拉赛特锭事件”发生[5],该事件不仅给患者身心健康造成了极大的危害,而且给药企造成了巨大的经济损失。2008年,欧洲药品监督管理局便发布了 EMEA/44714/2008文件,致函于所有药品中含以磺酸盐(甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐、对甲苯磺酸盐或苯磺酸盐)形式存在之药物活性成分之上市许可持有人,要求其对药品中甲磺酸烷基酯以及相关化合物进行风险评估[6]。2006年,欧洲药品评价局颁布了《基因毒性杂质限度指南》,引入毒理学关注阈值(threshold concern of toxicological,TTC)的概念,以此作为药物中基因毒性杂质控制的限度[7]。之后FDA和ICH也颁布了相关的指南对基因毒性杂质进行质量控制[8-9]。

本文参考欧洲药典9.0附录2.5.38甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸异丙酯在原料药中的测定法,采用碘化钠柱前衍生化,气相色谱分离,电子捕获检测器检测。

（2）考核内容。一是服务量考核。主要分为考核门诊诊疗人次、收治病人人数，出院人次、手术台次、床位使用率，医技科室按照计件服务数量考核。二是服务效率考核。主要考核药占比、次均费用、次均药费、医保按类别（省、市医保、城镇居民、异地医保、新农合）总费用控比、医保拒付比率。三是服务质量考核。包括医疗文书合格率，病案甲级率、科主任查房率、临床路径使用率、病种收费率，医疗安全事故率，感染发生率，基础护理合格率。四是服务行为考核。医院规章制度的遵守、药比、医疗核心制度执行、医疗收费与药品价格物价政策的执行、廉洁行医和病人满意度。

1 仪器与试药

色谱柱:Welch WM-INNOWAX(30 m×0.25 mm,1 μm)；载气:氮气；流速:1.0 mL/min；程序升温:起始柱温40℃,维持1 min,然后以10℃/min升至130℃,后运行温度260℃,后运行时间7 min；检测器:ECD,温度为260℃；顶空进样:顶空平衡温度为60℃,平衡时间为30 min,进样口温度为220℃,进样量为1 mL；分流比为20∶1。

99%甲磺酸甲酯(批号:A0356876)、99%甲磺酸乙酯(批号:A0341901)、99%甲磺酸异丙酯(批号:A0375206),Acros Organics；98%甲磺酸正丁酯(批号:WG0143739-160428001),Ark Pharm；99% ～100.5%碘化钠(Ph.Eur.,BP,USP,批号:L1504016),阿拉丁试剂(上海)公司；无水硫代硫酸钠(AR,批号:20161101),国药集团化学试剂有限公司；乙腈(色谱/光谱纯,批号:17025037),美国天地试剂公司；甲苯(AR,批号:160726844E),南京试剂有限公司；娃哈哈纯净水；甲磺酸伊马替尼原料药(批号:20161102),由相关企业友情提供。

衍生化溶液的制备:分别称取碘化钠和无水硫代硫酸钠适量,用水溶解稀释制成每1 mL中含1.2 g碘化钠和0.6 mg无水硫代硫酸钠的溶液(超声加快溶解)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent 7697A顶空自动进样器；Agilent 6890气相色谱仪；METTLER TOLEDO AB135-S电子天平；AUTOSCIENCE AS 20500A超声仪。

2.2 溶液配制

供试品-混合对照品溶液:精密称取甲磺酸伊马替尼25.00 mg,置20 mL顶空瓶中；加混合对照品溶液0.50 mL使溶解,加衍生化溶液0.50 mL,立即加盖密封,顶空进样器平衡。

在智慧图书馆背景下，图书馆服务不仅要从馆内向馆外拓展，而且要从被动等待向主动寻求转变。图书馆服务的优劣，有赖于图书馆员是否有敏锐的洞察力和非凡的创造力，是否能够时刻关注用户需求，了解如何利用新技术、建设新资源，最大程度地满足用户需求，提升服务质量。这要求图书馆员不仅要有扎实的专业能力，而且要有执着的服务信念。

系列混合对照品溶液:精密量取系列混合对照品溶液0.50 mL,置20 mL顶空瓶中,加衍生化试剂溶液0.50 mL,立即加盖密封,顶空进样器平衡。

从图6中可以看到当变压器铁芯中无直流偏置磁通时,测量绕组中仍能测得一定的电压输出,这是由传感器激励两边不完全对称以及比较器输出电平不对称引起的。随着直流偏置电流的增加,电压波形正负脉冲幅值和占空比均有明显变化。

系列混合对照品溶液的制备:精密量取混合对照品贮备溶液20 μL,置10 mL量瓶中,加内标溶液稀释至刻度,摇匀备用；精密量取该溶液 10、25、50、100、200、250 mL,置10 mL量瓶中,加内标溶液稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 样品前处理过程

本实验中甲磺酸烷基酯的衍生化过程与顶空平衡过程同时在顶空自动进样器中进行,供试品溶液、空白溶液和对照品溶液分别按下述过程前处理。

随着工作稳定，熟悉和适应了工作环境，关注学生、课堂和教学管理的教育信念和学生信念开始进入她的教师信念体系。

空白溶液:精密量取内标溶液0.50 mL,置20 mL顶空瓶中,加衍生化溶液0.50 mL,立即加盖密封,顶空进样器平衡。

混合对照品贮备溶液的制备:分别取MMS、EMS和IMS各25.00 mg,精密称定,置5 mL量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,即得。

取平衡后的系列混合对照品溶液顶空瓶内气体各1 mL,按“2.1”项下色谱条件,分别进样分析,记录各待测物及内标峰面积。以待测物浓度为横坐标(x),待测物与内标峰面积比为纵坐标(y),进行线性回归,结果见表1。

内标溶液的制备:精密量取甲磺酸正丁酯10 μL,置10 mL量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,备用。精密量取上述溶液20 μL,置100 mL量瓶中,加乙腈-水(8∶20)稀释至刻度,摇匀,即得。

2.4 专属性试验

取平衡后的空白溶液、混合对照品溶液(25 ng/mL)、供试品溶液和供试品-对照品溶液(25 ng/mL)顶空瓶内气体各1 mL,按 “2.1”项下色谱条件,分别进样分析,结果见图1,各待测物以及内标经碘化钠衍生化后的检测对象——碘甲烷(Mel)、碘乙烷(EtI)、碘代异丙烷(iPrI)和碘化正丁烷(BuI)的保留时间分别为4.52、5.11、55.37、7.29 min。由图1可知,各待测峰分离良好,空白溶液在EMS和IMS出峰处均无干扰,但在碘甲烷出峰处出现很小的干扰峰,经GC-MS确证系溶剂乙腈中存在的痕量杂质与碘化钠反应产生的碘甲烷,含量相当于约0.05 mg/kg MMS,远小于1.875 mg/kg,可忽略不计。

  

图2 专属性试验气相色谱图Fig.2 Gas chromatograms of specificity test

2.5 线性与范围考察

供试品溶液:精密称取甲磺酸伊马替尼25.00 mg,置20 mL顶空瓶中；加内标溶液0.50 mL使溶解,加衍生化溶液0.50 mL,立即加盖密封,顶空进样器平衡。

 

表1 线性与范围Table 1 Linearity and Range

  

MMS-MeI y=0.0582x+0.0513 0.9997 4.85～121.3 EMS-EtI y=0.0115x+0.0403 0.9993 5.00～125.0 IMS-iPrI y=0.0027x+0.0128 0.9978 5.10～127.5

2.6 检测限和定量限考察

取平衡后的空白溶液,连续进样6份,记录空白溶液图谱基线噪声值。取混合对照品溶液(10 ng/mL),加内标溶液逐级稀释成不同浓度后,按 “2.3”项下方法处理后进样分析,以信噪比约为10∶1的溶液浓度作为相应甲磺酸酯的定量限,以信噪比约为3∶1的溶液浓度作为相应甲磺酸酯的检测限,结果见表2。

 

表2 定量限(LOQ)和检测限(LOD)测定结果Table 2 Result of Limit of quantitation and Limit of Detection Test

  

待测物质 最低定量浓度/(ng/mL)LOQ/(mg/kg)最低检测浓度/(ng/mL)LOD/(mg/kg)MMS-MeI 4.852 0.194 1.456 0.058 EMS-EtI 2.500 0.100 0.750 0.030 IMS-iPrI 2.550 0.102 0.765 0.031

2.7 精密度试验

取平衡后的混合对照品溶液(25 ng/mL),按 “2.1”项下色谱条件,连续进样5次,记录色谱图。计算所得各待测物与内标峰面积比的RSD分别为3.90%、2.37%和2.14%,表明系统精密度良好。

2.8 重复性试验

精密称取甲磺酸伊马替尼25.00 mg,置20 mL顶空瓶中；加10、50、250 ng/mL混合对照品溶液0.50 mL使溶解,加衍生化溶液0.50 mL,立即加盖密封,顶空进样器平衡。每个浓度水平平行制备3份,分别进样分析,记录色谱图。计算低、中、高3个浓度水平下各待测物测得质量的RSD值,结果表明重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取甲磺酸伊马替尼25.00 mg,置20 mL顶空瓶中；加10、50、250 ng/mL混合对照品溶液0.50 mL使溶解,加衍生化溶液0.50 mL,立即加盖密封,顶空进样器平衡。每个浓度水平平行制备3份,分别进样分析,记录色谱图。计算低、中、高3个浓度水平下各待测物的回收率,结果见表3,表明该方法准确性良好。

4.2 冻害后采取人工辅助授粉的，效果显著人工辅助授粉提高了未受冻残留花的坐果率，明显减轻了产量损失。凤翔县范家寨镇盐坎村魏明田就是这样做的。他的3亩矮化中间砧短富苹果园套袋6万只，仅比去年少4 000只，2018年价格比上年提高1.5元/kg，实现收入9万元，收入比上年还略有增加。

 

表3 回收率试验结果Table 3 Result of Recovery Test

  

加标限度/ppm MMS-MeI回收率/%MMS-MeI回收率/%MMS-MeI回收率/%0.2 90.62 103.19 96.44 90.03 103.34 97.72 90.68 103.87 95.45 1 89.01 101.97 104.86 89.47 102.12 103.77 87.77 101.65 103.66 5 83.06 102.09 106.25 85.99 101.26 104.12 84.52 101.68 105.18平均回收率 87.91 102.35 101.94 RSD 3.16 0.87 4.09

2.1 0 稳定性考察

按 “2.2”项下方法制备混合对照品溶液(50 ng/mL),室温放置,分别于0、0.5、1、2、4、6、8 h后取样按 “2.3” 项下方法处理后进样分析。结果表明,混合对照品溶液中MMS、EMS和IMS室温放置8 h稳定。取按 “2.3”项下方法处理后的混合对照品溶液(25 ng/mL),放置于顶空进样盘中(室温),分别于0、0.5、1、2、3、4 h后进样分析。结果表明,前处理后的混合对照品溶液中MMS、EMS和IMS室温放置4 h稳定。

传统大学英语课堂教学往往以知识传授为重心，辅以少量的翻译、解释、问答等练习。在这一过程中，学生大多被动地接受语言知识。如果将在线课程学习与翻转课堂深度融合，必将形成一种创新性强，具备个性化、多元化特征的课堂模式。

2.1 1 样品测定

根据上述条件,对甲磺酸伊马替尼原料药中甲磺酸烷基酯进行检测,结果均未检测到。

3 结 论

甲磺酸烷基酯是一类具有代表性的基因毒性杂质,根据基因毒性杂质的毒理学可接受阈值(TTC)和药物的最大日剂量计算药物中基因毒性杂质的可接受限度,其公式为可接受限度(mg/kg)=TTC限度(μg/d)/药物的最大日剂量(g/d)[7]。甲磺酸伊马替尼最大日剂量为800 mg,计算所得甲磺酸烷基酯限度为1.875 mg/kg,由表3可知,该方法定量限远低于该限度,因此可灵敏而准确地测定。

甲磺酸烷基酯经碘化钠衍生化产物碘代烷采用电子捕获检测器检测具有较好的灵敏度和专属性,不亚于质谱检测器；同时比质谱检测器价格便宜、应用广泛、操作简便。

参考文献

[1] 丁倩倩,陈勤奋.甲磺酸伊马替尼的临床应用[J].上海医药,2013,34(3):5-9.

[2] Elder D P,Teasdale A,Lipczynski A M.Control and analysis of alkyl esters of alkyl and arylsulfonic acids in novel active pharmaceutical ingredients(APIs)[J].J Pharm Biomed Anal,2008,46(1):1-8.

[3] Szekely G,Sousa M C A D,Gil M,et al.Genotoxic Impurities in Pharmaceutical Manufacturing:Sources,Regulations,and Mitigation[J].Chemical Reviews,2015,115(16):8182-8229.

[4] European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare Alkyl mesilate(methane sulfonate)impurities in mesilate salts[S].Pharmeuropa,2000,12(1):27.

[7] EMEA/CHMP.CHMP Assessment Report for Viracept(EMEA/CHMP/492059/2007)[S].London:EMEA,2007.

[6] EMEA.THE FOLLOWING LETTER IS INTENDED FOR ALL MARKETING AUTHORIZATION HOLDERSFOR MEDICINAL PRODUCTS CONTAINING ACTIVE SUBSTANCES IN THE FORM OF MESILATES,(DI)ISETIONATES,TOSILATES OR BESILATES(EMEA/44714/2008)[S].London:EMEA,2008.

[7] EMEA/CHMP.Guidelineson thelimitsofgenotoxicimpurities(EMEA/CHMP/QWP/251344/2006)[S].London:EMEA,2006.

[8] Center for Drug Evaluation and Research(CDER).Guidance for industry:Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products:Recommended Approaches(Draft)[S].US Food and Drug Administration(FDA),2008.

[9] ICH Expert Working Group.Assessment and Control of DNA reactive(Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to LimitPotential Carcinogenic Risk Step 4 version[S].European Union,Japan and USA:ICH HARMONISED TRIPARTITE(ICH),2014.