0 引言

细胞培养技术已成为一种重要的研究手段，广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学及资源保护等方面，尤其是对珍稀濒危物种的保护具有重要意义[1].细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一.一般制作细胞生长曲线的方法是计数法或是XTT比色法[2]、CCK-8[3]、MTT比色法[4-5].传统的计数法不仅要求对同一样品计数几次取平均值，而且操作繁琐，费时费力.相比之下，MTT比色法广泛应用于各种细胞增殖的检测、细胞因子的活性检测以及抗肿瘤药物筛选等，方法简便，快速且无放射性.尽管如此，但由于MTT法会产生不溶物甲臜颗粒，往往因溶解不全而对实验结果造成影响，而且MTT法与细胞数目的线性关系差，检测时对样本的损伤和破坏使之不能用于后续研究.以上的这些细胞测试方法都是基于终点测验，不能连续实时监测，存在一定的局限性.因此迫切需要一种可靠的检测方法，来全面反映细胞的动态变化.

细胞电阻抗传感技术(electric cell-substrate impedance sensing，ECIS)是一种能对贴壁生长细胞的形态进行实时定量检测的独特方法，可在近似生理环境下通过测量细胞和微电极之间电阻抗的改变，动态地记录细胞增殖、细胞迁移、分化以及细胞形态的变化[6-8]，此外，在细胞信号转导[9]、凋亡药物和抗迁移药物的筛选和研究[10] 等方面具有很大的优势.研究细胞增殖时，通常会选择高频率的交流电，因为该频率下电流开始穿透细胞膜，流经细胞质，此时电容的改变，更能反映细胞膜完整性和细胞生理状态信息.在电极板上接种低密度细胞时，随着细胞增殖数目增多，覆盖在电极上的细胞也相应增多，电极上的阻抗值也相应增加，这样就可以通过阻抗值的变化来反映细胞的增长率.这种施加小信号的检测方法对细胞没有损伤，适合进行长时检测.

本研究采用匙吻鲟(Polyodon spathula)脾脏细胞系PSS1，运用ECIS技术和传统的细胞计数法分别探讨匙吻鲟脾脏细胞系PSS1的生长特性，并通过两者获得的生长曲线图，分析两种研究方法获得结果的一致性.研究表明，ECIS技术和细胞计数法获得的生长曲线结果具有较好的一致性.与传统的细胞计数法相比，ECIS技术是完全自动化的分析方法，实验数据有很好的重复性，有利于进行统计分析，这也为后续进行细胞体外培养最佳条件的筛选与评价提供了一种新的方法.

采用Minitab 17软件对数据统计分析,并对表2数据进行多元回归拟合,得到多酚提取率与磷酸氢二钾、乙醇和超声时间的二次多项回归模型

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂材料 ECIS Z 细胞动态分析仪、8 nm厚度透明金电极8W10E+(Applied Biophysics，Inc)，二氧化碳培养箱(Thermo Forma 3111)，倒置荧光显微镜(Olympus IX71)，细胞培养瓶(Corning)，RPMI-1640培养基、MEM培养基、DMEM培养基、M199培养基、0.25%胰酶、无菌PBS、胎牛血清(Gibco公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma)，匙吻鲟脾脏细胞PSS1(中华鲟研究所三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室分离获得).

 

表1 正交试验方案

  

实验组培养基培养温度/℃胎牛血清1RPMI⁃1640150%2RPMI⁃16402010%3RPMI⁃16402520%4RPMI⁃16403030%5MEM1510%6MEM200%7MEM2530%8MEM3020%9M1991520%10M1992030%11M199250%12M1993010%13DMEM1530%14DMEM2020%15DMEM2510%16DMEM300%

以历史的脉络审视，商标权是个人权利与公共利益折中的产物。细言之，商标权既为商品或服务提供者作为指示商品或服务、培育品牌所用，也为国家维持正常品牌竞争秩序、造福广大消费者所用。依据康德与卢梭的观点，所有权产生于个人意志与国家意志的结合。但所有权产生的基础确是个人的劳动，公权力的运行只是为其提供一个庇护的港湾。正如为了保护更多更广泛意义上的自由而限制自由一样，为了保障更多更广泛意义上的商标权而限制商标权，而利益平衡下的表象使得我们误把限制、平衡作为目的。

2.2 传统计数法获得的细胞生长曲线 运用4种不同的培养基PMI-1640、MEM、DMEM和M199，分别添加20%FBS，于25 ℃培养箱中培养匙吻鲟脾脏细胞，细胞在这4种培养基中均能稳定增长与繁殖，612 d间细胞呈近似对数增长，结果显示，脾脏细胞在DMEM培养基中增殖速度最快，其次是MEM、M199培养基.生长曲线结果如图3所示.

2 结果

2.1 细胞电阻抗法ECIS实时监测获得的细胞生长曲线 采用正交试验法，研究匙吻鲟脾脏细胞在体外培养的最佳条件，正交实验结果如图1显示：

老砍头的家也挨着钱葱河，光房子就有一百多间。秀容川找到他的时候，老砍头正在厨房烧锅。厨房只有他一个人，他坐在板凳上，正把草一把把塞入锅腔，火烧得很旺，再烧一会，锅里的水就开了。

  

图1 不同培养温度下PSS1细胞的生长曲线A: 15 ℃；B: 20 ℃；C：25 ℃；D：30 ℃

A 图表明在培养温度为15 ℃的4个条件组合下，培养基为MEM、血清浓度为10%的条件下的阻抗值的最大变化量，约为46.3 ohm，细胞后期的增殖速度非常快；

本研究采用匙吻鲟(Polyodon spathula)脾脏细胞系PSS1，运用ECIS技术和传统的细胞计数法分别探讨匙吻鲟脾脏细胞系的生长特性，并通过两种实验方法获得PSS1的生长曲线图，分析两种研究方法获得的结果一致性.研究表明，ECIS技术和传统的细胞计数法获得的生长曲线的结果具有较好的一致性.与传统的细胞计数法相比，ECIS技术可实现实时、定量、无标记和自动化方式监测细胞的动态变化.研究结果显示，ECIS检测技术不仅可以替代传统的细胞计数法用于细胞生长特性的研究，而且在其他基础研究和药学研究领域也将得到广泛应用.

D 图增殖曲线表明在培养温度为30 ℃的条件组合下，培养基为M199、血清浓度为10%的条件以及培养基为MEM、血清浓度为20%的2个条件优于其他2个条件，阻抗值的最大变化量均在900.0 ohm以上 ；但在细胞的增殖后期，尤其是培养200 h之后，培养基为M199、血清浓度为10%的条件培养下的细胞增殖速度急剧下降，原因可能是由于温度过高，导致细胞的结构发生变化，无法正常生长繁殖.

综上所述，采用传统细胞计数法，研究匙吻鲟脾脏细胞在体外培养的最佳条件，细胞计数统计结果显示：最适宜的培养温度为25 ℃，最适宜的血清浓度是20%，最佳的培养基为DMEM，这虽然与肖艺等所研究的匙吻鲟鳍条细胞的最佳培养条件结论不太一致[11]，估计是不同的组织细胞对培养的环境条件要求不一样的原因，但本研究结论与运用ECIS技术研究得到的结论呈现一致性.

2018年9月17日，江苏省检察院通报，江苏省扬州市国资委原党委书记、主任黄道龙（正处级，已退休）涉嫌受贿罪、贪污罪被检察院批准逮捕。

1.2 生长曲线测定方法 传统细胞计数方法[11]：根据培养基(RPMI-1640、MEM、DMEM和M199)血清浓度(0、10%、20%和30%)，培养温度条件(15、20、25、30 ℃)，共设定12个实验组别，来确定最佳的培养基、血清浓度和培养温度条件.每个培养瓶的种板浓度为5.6×104 个/cm2，每个实验组每2 d取出2瓶细胞经胰酶-EDTA消化后分别进行细胞计数，连续计数6次，共培养12 d，根据细胞计数的结果，采用Excell软件绘制相应条件下的生长曲线.

综上所述，16个实验组条件下匙吻鲟脾脏细胞(以下均简写为PSS1)的增殖情况综合比较如图2所示：培养温度在2025℃； 血清浓度含量在10%20%；培养液选择DMEM或MEM，细胞生长状态较为理想，其中最佳的条件组合为：25 ℃，20% FBS，培养基为DMEM.

  

图2 各实验组PSS1细胞的生长曲线综合比较

  

图3 不同培养基培养PSS1细胞的生长比较

ECIS方法：按3因素4水平来设计正交试验方案，共16个实验组(见表1)，实验前一天，在每个电极板上的电极孔中加入相应的培养基用于平衡基线.收集匙吻鲟脾脏细胞悬液，接种到ECIS电极板中，浓度为1×104 个/cm2.同时监测8个ECIS电极板孔阻抗的变化，每隔20 min收集一次，持续监测260 h左右.电极板为8W10E+，每个孔含有10个并联的小电极.监测频率为16 kHz，以阻抗值中电阻部分为功能监测参数监测细胞增殖情况，每培养72 h，更换培养基，最终得到阻抗值的变化与细胞在电极板上的覆盖度呈线性相关的曲线图.

选取DMEM为培养基，分别添加含0%、10%、20%和30%浓度血清，在25 ℃培养箱中培养匙吻鲟脾脏细胞，以确定最佳的血清浓度.结果显示，在不含FBS的培养基里，脾脏细胞的贴壁数量越来越少，最终无法贴壁生长；细胞在含20%和30%DMEM培养基增殖速度明显优于含10%的FBS培养基里，且在410 d间呈近似对数增长.但含30%血清的培养基中的细胞在后期脱落较为明显.生长曲线结果如图4所示.

以含20%的FBS的DMEM作为培养基，分别在15℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃ 4个温度培养箱中培养匙吻鲟脾脏细胞，结果显示，在15 ℃培养温度下，细胞贴壁正常，但生长速度较为缓慢，而在20 ℃和25 ℃的培养条件下，细胞都能保持稳定增殖，尤其是25 ℃的培养条件，细胞的数目最高可达6×105个/瓶，而在相对高温30 ℃ 条件下，随着培养天数的增加，细胞逐渐死亡脱落.生长曲线结果如图5所示.

  

图4 不同血清浓度培养PSS1细胞的生长比较

  

图5 不同培养温度条件PSS1细胞的生长比较

C 图增殖曲线表明在培养温度为25℃的条件组合下，除培养基为M199、血清浓度为0%的条件下的阻抗值的变化量几乎没有发生变化，其他3个条件下的细胞都能稳定增长与繁殖，其中培养基为DMEM、血清浓度为10%以及培养基为MEM、血清浓度为30%的培养条件明显优于培养基为RPMI-1640，血清浓度为20%条件，阻抗值的最大变化量均在1 500.0 ohm以上；

3 讨论

B 图表明在培养温度为20 ℃的条件组合下，除培养基为MEM、血清浓度为0%的条件下的阻抗值的变化量几乎没有发生变化，其他3个条件下的细胞都能稳定增长与繁殖，其中培养基为DMEM、血清浓度为20%的培养条件明显优于其他组合，阻抗值的最大变化量接近1 600.0 ohm ；

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传统计数法方法简单，但费时费力，且误差较大.较常用的MTT比色法是在一定细胞数范围内MTT结晶形成的量与细胞数成正比，具有灵敏度高、经济便捷的特点.但由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需要被溶解后才能检测.这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，更重要的一点是MTT方法是损伤性的，这对于一些较珍贵稀有的细胞来说无疑是不可靠的选择.

ECIS技术可通过细胞形态学改变、细胞粘附与细胞增殖的监测，追踪细胞变化与细胞死亡情况.相对基于单点实验的传统检测方法(如MTT法)，ECIS技术能提供多参数、无标记、无损伤的细胞实时动态监测，并给出相应的时间响应曲线或剂量响应曲线.

总之，ECIS检测技术适用于贴壁细胞的细胞生长检测，尤其是珍贵稀有类细胞，获取结果快速直接，对细胞无损伤.当细胞贴壁面积增加，电阻值升高，反之细胞凋亡、脱落，电阻值下降.与传统检测方法相比，ECIS技术系统可实时监测细胞增殖引起电极板的电阻抗变化，实验偏差更小，重复性好，是进行细胞生长特性研究时的一个客观可信的选择.

对图像采集分类的标准方法主要是通过区分光谱特性来进行的,而在遥感影像图像采集过程中,对被采集图像的几何内容,如线条、角点、矩形等参数具有重要的作用。这主要是基于人造物体(比如建筑物)呈现出较为规则的几何结构的假设。根据遥感影像采集到的原始信息来描述地面被采集物体,能够更好地区分真正的人造建筑物和其他类型的土地覆盖物。

4 参考文献

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