0 引言

猕猴桃为猕猴桃科、猕猴桃属(Actinidia)植物，其果富含对人有益的维生素、氨基酸、胡萝卜素和花青素，尤其是维生素C含量高，具有很高的营养价值和良好的保健功能.我国是猕猴桃的故乡，也是猴桃种植大国.目前，栽培的猕猴桃多为中华猕猴桃(A. chinensis)品种，其次有美味猕猴桃(A. chinensis var. deliciosa，中华猕猴桃的变种)和软枣猕猴桃(A. arguta).

“金魁”是湖北省农业科学院果树茶叶研究所选育的一个美味猕猴桃优良品种.其平均果重100 g以上，最大可达250 g，果肉汁多味美、甜酸可口，含可溶性固形物18%25%，总糖13%、有机酸1.6%1.8%，维生素C含量110242 mg/100 g [1-3].由于具有品质佳、丰产性好、抗逆性强、耐贮运、货架期长等优点，近10多年来 “金魁”是我国猕猴桃的主栽品种之一，其栽培技术已有不少报道[2-7].

然而，“金魁”猕猴桃的扦插生根比较困难，生产上常用嫁接繁殖，但用生长素IBA(吲哚丁酸，Indole-3-butyric acid)处理“金魁”猕猴桃插穗，并在温床上扦插，可使生根率达到80%[8].众所周知，利用植物组织培养技术繁殖植物具有速度快、效率高，并可以对植物进行脱菌、脱毒等优点.但有关”金魁”猕猴桃组培技术报道极少.黄胜男等以茎段培养得到的”金魁”猕猴桃无菌苗叶片为外植体，研究了细胞分裂素6-BA(6-苄基氨基嘌呤，6-benzylaminopurine)和生长素NAA(萘乙酸，1-Naphthaleneacetic acid)对不定芽诱导的影响，发现3 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的组合不定芽诱导率最高(94%)，不定芽在含0.7 mg/L IBA培养基上的生根率为100%，但他们没有报道芽增殖和组培苗移栽方法[9].本文报道植物激素对“金魁”猕猴桃成熟叶分化不定芽、芽增殖与生根的影响，以及组培苗的移栽方法，总结出一套高效、可行的“金魁”猕猴桃组培快繁技术.

1 材料与方法

1.1 材料 “金魁”猕猴桃完全伸展、健康的叶片采于中国科学院武汉植物园.

1.2 外植体的消毒 叶片用自来水和洗涤剂清洗后，在含1%有效氯的次氯酸钠溶液(含0.2%吐温20)中消毒15 min，然后用无菌水漂洗3次.将叶片边缘切除后，再将叶片切成0.5 cm × 0.5 cm的小块，接种在含不同浓度萘乙酸(NAA)和6-苄基氨基嘌呤(6-BA或BA)或噻苯隆(TDZ)的不定芽诱导培养基上.不定芽诱导试验为50 d.

2.1 愈伤组织和不定芽的诱导 接种34 d后，不同培养基上的叶块都有所增大，随后边缘处形成愈伤组织，进而分化不定芽.细胞分裂素的种类(BA和TDZ)和浓度对愈伤组织和不定芽的诱导有很大的影响(表1).在含12 mg/L BA的培养基上，叶块大约在培养2周后形成愈伤组织、6周后出现不定芽，50 d后不定芽形成率分别为5.6%和29.0%；在含3和5 mg/L BA的培养基上，叶块大约810 d后出现愈伤组织、5周后形成了不定芽(图1a)，最终, 愈伤组织和不定芽形成率分别达为100%和45%50%.在含1或2 mg/L TDZ培养基上，所有叶块在7 d内形成愈伤组织，3周后开始出现不定芽，最终, 不定芽诱导率达到90%以上，甚至100%.但两种浓度TDZ所诱导的芽在形态上有很大的差异，在1 mg/L TDZ培养基上形成的芽比较正常(图1b)，而在2 mg/L TDZ培养基上愈伤组织生长旺盛，所形成的芽大都出现玻璃化症状(图1c).

2.2 芽的增殖培养 叶片形成的不定芽转到无激素的培养基上后生长并不理想，一个月内只有少许伸长.将芽(长的芽切成小段)转到含0.5 mg/L GA3的培养基上后，芽的生长得到显著改善，培养4周后，大部分茎段可以长成34 cm长的幼茎，但有部分茎段没有长出新芽.为了研究BA和GA3浓度对芽增殖的影响，我们将芽切成小段、接种到含不同浓度BA和GA3的培养基上.结果表明，0.5或1.0 mg/L GA3促进芽伸长生长的效果都比较好，两者没有明显差异，但芽的生长与BA浓度有关.在无BA时，带顶芽的茎段都能伸长，而不带顶芽的茎段只有部分(大约50%60%)可以长出1个幼茎；在含0.1 mg/L BA的培养基上，大约90%的芽段可以长出1个幼茎；在含0.3和0.5 mg/L BA的培养基上，每个芽段可以长出23个幼茎(图1d)，因而增殖系数(4.64.9)显著高于无BA和0.1 mg/L BA的处理(表2).

在无激素培养基上“金魁”茎段侧芽的生长率低，且伸长少.但在含0.30.5 mg/L BA和0.5 mg/L GA3的培养基上，芽的增殖得到显著改善，一个月内所有茎段可以形成了23个24 cm高的幼茎，增殖系数达到4.55倍.这是由于细胞分裂素(BA)能刺激茎段侧芽萌动生长、赤霉素(GA3)能促进芽伸长生长的缘故.本研究中“金魁”芽的增殖效率与报道的中华猕猴桃“红阳”[16]和美味猕猴桃‘“海沃德”[13]芽的增殖效率相当，但这些猕猴桃的芽增殖培养基中BA浓度比较高(24 mg/L).

1.5 培养基与培养条件 本实验中所用的基本培养基为大量元素减半的MS培养基[10]，含20 g/L蔗糖和8 g/L琼脂.BA、TDZ、NAA和IBA等植物激素购自美国Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯.叶片不定芽诱导培养基含0.2 mg/L NAA和15 mg/L BA或12 mg/L TDZ，增殖培养基含00.5 mg/L BA和0.5或1.0 mg/L GA3(赤霉素)，生根培养基含01 mg/L IBA.所有培养基pH值为5.8，在121 ℃下消毒15 min.培养室温度为(25 ± 1) ℃，光照强度为3540 μmol m-2 s-1，光周期为16 h.

建立高效的不定芽诱导方法对于猕猴桃快速繁殖及转基因植株的培育都具有重要意义，还可以用于培育多倍体猕猴桃[11].美味猕猴桃是栽培猕猴桃的重要类型之一，有关其叶片不定芽诱导方法已有一些报道，但都是以组培苗的幼嫩叶片为外植体，不定芽诱导的最佳激素组合因品种不同而有所不同，如“秦美”为6.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA [12]、“海沃德”为3 mg/L BA+0.1 mg/L NAA [13]、“金魁”为3.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA [9]，诱导率可以达到80%以上.Wu等[11]用0.916.84 μmol/L玉米素(zeatin，ZT)诱导中华猕猴桃品种“Hort16A”幼叶外植体形成不定芽时，发现不同叶块间形成不定芽的差异很大，有的叶块可以形成多个芽，有的则不能形成芽(具体的不定芽诱导率未说明).在本研究中，“金魁”猕猴桃成熟叶在含15 mg/L BA与0.2 mg /L NAA培养基上分化不定芽的效率比较低(最高为50%)，但在含1.0 mg/L TDZ与0.2 mg /L NAA的培养基上，不定芽诱导率可以达到90%以上(表1)，说明当使用TDZ作为细胞分裂素时，“金魁”成熟叶同样可以高效率分化不定芽.王顺才等[14]和Zhang等[15]也分别发现TDZ诱导“海沃德”猕猴桃叶片和葡萄“Wink”品种叶片形成不定芽的效果显著好于BA和ZT.

2 结果与分析

1.3 芽的增殖培养 将叶片形成的不定芽切下、接种在无激素的培养基上.1个月后，再将芽(长的芽切成23段)转到含0.5 mg/L GA3(赤霉素)的培养基上.将在此培养基上增殖的芽切成0.71.0 cm长的小段，每段带12个芽，接种到含不同浓度BA和GA3的培养基(表2)上，以寻找适合其增殖的激素组合.1个月后，再将增殖的芽切成小段，接种在新鲜的增殖培养基上，进一步验证芽的增殖效果.芽的常规增殖在含0.3 mg/L BA和0.5 mg/L GA3培养基上进行.

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表1 BA和TDZ浓度对”金魁”猕猴桃成熟叶外植体形成不定芽的影响

  

细胞分裂素/(mg/L)BATDZ愈伤组织形成率/%不定芽形成率/%156．6±1．1a5．6±1．1a293．3±1．9b28．9±2．9b3100．0±0．0c45．5±2．2c5100．0±0．0c50．0±1．9c1100．0±0．0c92．2±1．1d2100．0±0．0c100．0±0．0e

同一栏带有相同字母的数据表示彼此之间差异不具有统计学意义(α=0.05)

  

图1 “金魁”猕猴桃成熟叶不定芽诱导、增殖与植株再生

1.4 芽的生根与组培苗移栽 将在增殖培养基上形成的芽切成23 cm长(带顶芽)、接种在含01 mg/L IBA(吲哚丁酸，生长素)培养基上进行生根试验.生根培养持续5周.

（4）二诊治疗情况。患者服药一个疗程后，关节腰酸背痛症状明显减轻，但仍有乏力汗出症状。原方去桂枝、怀牛膝，加黄芪、党参，继续服用一个疗程。原有症状全部消失，临床全愈。

2.3 植株再生与移栽生长 IBA对“金魁”芽生根有显著的促进作用.在无IBA的基本培养基上，“金魁”芽生根晚、生根率低、根数少；而在含0.51 mg/L IBA培养基上，芽在接种79 d后开始生根，5周后生根率达到70%100%、每株平均根数达到3.38.5条，均显著高于对照(表3).虽然1 mg/L IBA可以促进芽多生根，但同时也显著促进了愈伤组织的形成和生长，而且许多根是由愈伤组织形成的(图2f).而在含0.7 mg/L IBA培养基上，芽基部只形成很少的愈伤组织，根几乎都是由芽直接形成的，生根质量好(图2e).

 

表2 GA3和BA浓度对“金魁”猕猴桃芽增殖的影响

  

激素/(mg/L)GA3BA芽生长率/%增殖系数0．50．058．9±2．2a2．6±0．1a0．50．192．2±1．1b3．3±0．2b0．50．3100．0±0．0c4．9±0．2c1．00．5100．0±0．0c4．7±0．1c1．00．196．6±1．9b3．2±0．1b1．00．3100．0±0．0c4．8±0．1c1．00．5100．0±0．0c4．6±0．1c

同一栏带有相同字母的数据表示彼此之间差异不具有统计学意义(α=0.05)

 

表3 IBA浓度对“金魁”猕猴桃芽生根的影响

  

IBA/(mg/L)最早出现根时间生根率/%平均根数/株01546．7±3．6a1．6±0．15a0．5972．5±2．9b3．3±0．27b0．77100．0±0．0c5．2±0．38c1．07100．0±0．0c8．5±0．75d

同一栏带有相同字母的数据表示彼此之间差异不显著(α=0.05)

  

图2 移栽3个月后的“金魁”猕猴桃组培

将在含0.7和1.0 mg/L IBA培养基上再生的植株移栽到温室，710 d后植株有所伸长，幼叶明显增大，但这两种组培苗的后来生长出现明显差异.在0.7 mg/L IBA培养基上形成的组培苗一直生长良好，一个月后成活率达到100%，移至室外自然条件后也生长正常(图2)，两个月后的成活率达到96%.在1 mg/L IBA培养基上再生的部分组培苗在温室栽培2周后开始出现萎蔫，补浇水并不能使其恢复，最终死亡，移栽一个月后的成活率只有44%.拔起死亡植株后，发现这些植株基部原有的愈伤组织及根已变黑、腐烂.

3 讨论

1.6 数据分析 各试验均重复3次，利用IBM SPSS 软件对数据进行方差分析和邓肯检验(Duncan’s test，α=0.05)，百分数先转换成反正弦后再进行统计分析.

只有认识到著作权为仅赋予著作权人许可或禁止他人以法律规定的方式利用其作品，才是对著作权正确的理解。如何理解《著作权法》第10条要具体规定著作权人的16项具体权利，而不是像物权那样概括规定物权人的权利？这正是一种对著作权人垄断其作品的限制，使其只能限制他人以有限的特定方式利用其作品，而这以外的其他利用行为，如对作品的阅读、背诵，乃是公众的自由，以体现“法无禁止即自由”，保证公众对作品的自由接触权，进而促进作品的流通，最终达到知识产权法促进知识和信息的广泛传播，促进经济的发展和科技、文化进步⑲ 冯晓青著：《知识产权法利益平衡理论》，中国政法大学出版社2006年版，第82页。的最终目的。

将在0.7和1.0 mg/L IBA培养基上再生的组培苗移至温室，打开瓶盖，3 d后取出组培苗，并用自来水清洗，移栽到盛有基质的塑料盆中，基质由4∶3∶3的田园土、泥炭土和河沙组成.温室内温度为2327 ℃，湿度为60%80%.组培苗移栽时浇足水，以后等基质表面稍干时再浇，但对出现萎蔫的组培苗及时补水.一个月后，将苗移至室外，适时浇水.

4种沉水植物种植方式的试验样方设置见表1，即分别在N1、N4、N7、S1样方进行播种法种植，在N2、N5、N8、S2样方进行移植法种植，在N3、N6、N9、S3样方进行扦插法种植。用播种法种植时，均以20颗/m2的密度均匀播撒休眠芽和种子。用移植法种植时，均选择株高30 cm左右的植株，苦草和黑藻用底泥包裹根部成锥形直接种至样方，金鱼藻和狐尾藻用底泥包裹根部成锥形后再用无纺布包裹，密度均为10株/m2；用扦插法种植时，均选择株高30 cm左右的植株，直接插入底泥中约5 cm，密度均为10株/m2。试验时间为2017年4—9月。

组培苗的生根质量对其移栽成活率影响很大.IBA和NAA是诱导猕猴桃生根最常用的激素，其效果因猕猴桃种类、品种而异.黄胜男等报道“金魁”芽在0.5、0.7和0.8 mg/L IBA培养基上的生根率分别为78%、100%和55.6% [9].我们的“金魁”芽生根试验结果(表3)与黄胜男等的结果基本一致，但我们发现在1.0 mg/L IBA培养基上“金魁”芽也可以100%生根，只是芽基部的愈伤组织生长比较旺盛，根多由愈伤组织形成.移栽后，这种组培苗由于基部的愈伤组织容易受到微生物感染而腐烂，造成死苗、移栽成活率低.因此，诱导“金魁”芽生根的IBA浓度还是以0.7 mg/L为佳.

由表1可见，2012年增设槽身支座处理完成至今，渡槽槽身细裂缝数量和长度仍有较大增加，渗漏问题仍较严重。

总之，“金魁”猕猴桃成熟叶外植体在含1.0 mg/L TDZ和0.2 mg/L NAA培养基上可以高效分化不定芽；不定芽形成之后，可以通过茎段培养在含0.3 mg/L BA和0.5 mg/L GA3的培养基上反复增殖，一个月增殖4.55.0倍；所增殖的芽在含0.7 mg/L IBA培养基上可以100%生根，形成完整的植株.根据本试验所建立的方法，以一个“金魁”猕猴桃成熟叶片为起始材料，一年内可以生产出数百万小苗.该方法对于“金魁”猕猴桃的种苗生产及转基因植株的培育有很好的参考价值.

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