心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）是心肌肌钙蛋白复合物的亚单位，存在于心肌肌原纤维细肌上［1］，是心肌细胞的重要结构蛋白，也是心肌中的特有物质［2］.在心肌细胞膜完整时，cTnI不能透过细胞膜进入血循环.当心肌缺血时，细胞膜的完整性受损，细胞内的cTnI便快速释放到血液中，使其在血液中的含量迅速升高，可达100～1300 ng/mL［3］，而正常人血清中cTnI＜0.06 ng/mL. 近年来的研究结果表明，由于cTnI具有发生心肌梗死时在血液中出现的时间早、敏感度高、特异性强和诊断窗口期长等特点［4］，使其成为诊断急性心肌梗死（AMI）、不稳定心绞痛（UAP），以及监测各种因素导致的心肌损伤等疾病的理想指标［5］.常用的cTnI检测方法有化学发光免疫分析法、酶联免疫分析法、放射免疫分析法、免疫荧光法和胶体金免疫层析法等［6］.其中，胶体金免疫层析法具有更加简便、快速和无需特殊仪器设备等特点，尤其适用于急诊病例的快速检测和床边检测，为急性心肌梗塞患者赢得宝贵的抢救时间［7］.本研究利用作者单位细胞室研制生产的高特异性和高亲和力的鼠源抗cTnI单克隆抗体和兔抗鼠IgG［8］，根据双抗体夹心法及胶体金免疫层析法的原理，制备了cTnI胶体金免疫层析试纸条［9］，与化学发光免疫分析法结果进行对比分析，评价该方法的灵敏度、特异性和适用性.

3.2.3 单纯活检 如果TURBT术中观察见肿瘤浸润肌层可能性大，也可考虑单纯行肿瘤边缘和基底部活检。但若病检结果未能证实浸润，则需行二次电切，除非有其他因素促使行膀胱癌根治术。

1 材料和方法

1.1 材料

鼠源抗cTnI单克隆抗体和兔抗鼠IgG由作者单位细胞室制备，3C9用于标记，1D2用于包被；氯金酸（HAuCl4·4H2O）为Sigma公司产品；硝酸纤维素微孔滤膜（NC）为美国Millipore公司产品.

1.2 胶体金标记物的制备

1.2.1 胶体金溶液的制备 参照文献［10］进行.取体积分数0.01%HAuCl4水溶液100 mL，加入10 g/L柠檬酸三钠水溶液2 mL，加热煮沸15～30 min，直至颜色变红，即为胶体金溶液.

1.2.2 胶体金标记的最佳pH测定［11］取10 μg/mL单抗3C91.0 mL，分别加入1.0 mL pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、7.8、8.5、9.3、9.8的胶体金溶液中，混匀，室温下放置5 min；再分别加入体积分数10%NaCl溶液0.1 mL，混匀，静置2 h后观察结果，确定金标记最佳pH值.

大面积烧伤后的创面表面为新鲜的肉芽组织,经过细菌培养其阳性率较高,在创面的愈合过程中,需采用良好的抗菌及良好的修复创面药物,使创面表面细菌含量减少,促进创面能够有效向中心方向愈合[4]。磺胺嘧啶银锌霜就能起到杀菌抑菌、抗感染及促进上皮生长的多重疗效。磺胺嘧啶银锌霜中含有的SD-AG具有较强的杀菌作用,其中含有的锌离子(SD-Zn)除了具有杀菌作用外,还兼顾着修复创面的独特优势。因此,将磺胺嘧啶银锌霜涂抹在患者烧伤创面上,能够在创面上形成一层抗菌屏障,避免外界环境细菌的侵入,同时SD-Zn可通过与机体去氧核糖核酸的结合,抑制细菌的繁殖,不仅具有良好的抗菌作用,同时还能起到修复创面的功效[5]。

1.2.3 最适标记蛋白浓度的测定［12］取10支试管，各加入1.0 mL胶体金溶液，将单抗3C9分别稀释成13.0、12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0、6.0、5.0 μg/mL，各取1.0 mL按顺序加入上述胶体金溶液中混匀；对照管加入1.0 mL稀释液（不含蛋白质）.将所有试管在室温下放置5 min，再分别加入体积分数10%NaCl溶液0.1 mL，混匀，静置2 h后观察结果，确定最适标记蛋白浓度.

含蛋白质量少不能稳定的胶体金溶液各管呈现由红变蓝聚沉现象，而加入蛋白质达到或超过最低稳定量，试管胶体金溶液则保持红色不变.由表1得知，稳定胶体金的最低蛋白量为9.0 μg/mL，再加此量的20%即为稳定1 mL胶体金所需蛋白质（抗体）的实际用量.因此，免疫胶体金的最佳标记蛋白量为每11.0 μg/mL.

1.3 包被膜的制备

将试纸条置2～8℃条件下干燥保存，每月定期抽检至第13个月，与新制备的试纸条平行检测阳性和阴性，比较两者的检测结果.

1.3.2 单克隆抗体1D2及多抗兔抗鼠IgG的包被 参照文献［14］.分别将两种抗体装入两支洁净专用扫描笔中，将测试带（1D2）和质控带（兔抗鼠IgG）宽度均设定为0.1 cm，二者间距为1.0 cm，位于NC膜中部；将程序输入自动点膜机，进入工作状态；按启动键，开始包被，做标记符号.将包被有抗体的NC膜置于pH 7.0、浓度为0.01 mol/L PBS-1%BSA封闭液中在37℃条件下60 min，干燥，即为包被膜.

1.4 试纸条组装

取洁净PVC板，将包被膜用双面胶固于PVC板固定位置上，将棉浆板连接在NC膜上端，玻璃纤维连接包被膜下端，胶体金标记物附着在玻璃纤维下，与包被膜衔接，色膜覆盖于棉浆板之上，MARK标志膜覆盖于玻璃纤维之上，均匀、轻微滚动式推进以加强黏和力.用切割机将贴好的板切割成所需宽度的条，即为成品试纸条.

1.5 测试方法

用本实验室研制的cTnI胶体金免疫层析试纸条，对38例心肌损伤患者血清和25例健康献血者的血清，分别和美国贝克曼公司生产的化学发光免疫分析法试剂盒进行对比，观察检测结果.

1.6 胶体金免疫层析试纸条的特异性测试

用cTnI试纸条分别对2.5 mg/mL血红蛋白、8.0 mg/mL胆固醇、cTnT和cTnC进行检测，试验重复3次.

1.7 胶体金免疫层析试纸条的敏感性测试

测试结果如表3.结果采用1D2 2 mg/mL、兔抗鼠IgG 4 mg/mL的包被量即可满足所需灵敏度的要求，增加包被抗体的浓度不提高测试灵敏度.

1.8 胶体金免疫层析试纸条的稳定性测试

1.3.1 包被抗体浓度的确定 纯化的单抗1D2和兔抗鼠IgG分别用0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的自动点膜机包被制备成包被膜，与同一批胶体金标记物装配成试纸条，观察结果，确定包被抗体的最佳浓度.

1.9 胶体金免疫层析试纸条的精密性测试

用10.0 ng/mL的质控品平行检测，观察结果.

急性肾衰伤患者分级：患者的急性肾衰伤分级根据全球肾病预后组织制定的急性肾衰伤进行判断，主要分为三期：急性肾衰伤Ⅰ期：血清肌酐值增加超过26.5 μmol/L，或者增加基线值在1.5～1.9倍；急性肾衰伤Ⅱ期：血清肌酐值增加基线值在2.0～2.9倍；急性肾衰伤Ⅲ期：血清肌酐值增加基线值在3倍以上。

(4)提高产品的可设计性。CFRP性能多样，其物理性能、化学性能、力学性能均可以通过合理选择原材料的种类、配比、加工方法、纤维含量和铺层方式进行设计。由于树脂基体材料种类很多，其选材设计的自由度很大，这是传统的各向同性材料(比如钢、铝)所不具备的。另外，CFRP可以实现一体化制造，其制品是由材料和结构同时完成，即通过合理的模具设计，把不同厚度的零件、凸起部分、筋和棱等全部一体成型。整体成型同时还能提高结构的完整性、气密性和保温性，以及提高车辆舒适度。

1.10 临床考核

将cTnI胶体金免疫层析试纸条带MARK标志线一端插入装有样品的容器中，样品通过玻璃纤维的层析作用上行与胶体金标记物（Au-3C9）结合形成抗原抗体（Au-3C9-cTnI）复合物，再移行至包被膜上抗cTnI单抗（1D2）带区，即和1D2结合，构成Au-3C9-cTnI-1D2双抗体夹心复合物，呈现出目测可见的红色条带［15］.全部试验过程仅需5～10 min.测定结果判断：试纸条测试带不显色仅质控带显色，出现1条红线为阴性；试纸条测试带和质控带均显色，出现2条红线为阳性；试纸条质控带无红线出现则为测试无效.

2 结果

2.1 胶体金标记的最佳pH测定

胶体金溶液的pH由5.55至6.0时，颜色由蓝灰变成暗红；当胶体金溶液pH为6.5、7.0、7.4、7.8、8.5、9.3、9.8时，免疫胶体金溶液稳定，颜色鲜艳.胶体金标记蛋白时最佳pH为6.5.

2.2 最适标记蛋白浓度的测定

1.2.4 单克隆抗体3C9胶体金标记物的制备 参照文献［13］.取胶体金100.0 mL，用0.1 mol/L K2CO3调pH值，在搅拌条件下快速加入单克隆抗体3C9，继续搅拌30 min后，加入BSA至10.0 g/L；再继续搅拌15 min，3000 r/min离心5 min，弃沉淀物；将上清液再12 000 r/min离心15 min，小心吸弃上清液，沉淀物以pH 7.0、浓度为0.01 mol/L PBS-2%BSA溶液溶解，即为胶体金标记溶液.将玻璃纤维浸泡于胶体金标记溶液中，待完全浸泡均匀后，取出干燥，即成单克隆抗体3C9胶体金标记物.

 

表1 免疫胶体金标记蛋白用量的测定Tab.1 Determination on the amount of protein in labeling colloidal gold

  

管号抗体/（μg·mL-1）最终显色123456789 13.0红12.0红11.0红10.0红9.0红8.0暗红7.0暗红6.0蓝灰5.0蓝灰10 0蓝灰

2.3 胶体金标记溶液的最适稀释度

试纸条检测50.0、10.0、5.0、2.0、1.0 ng/mL试纸条，检测线与质控线均出现红色条带，表明检测结果为阳性；而0.5 ng/mL样品检测线处显色可疑；0.25 ng/mL仅在质控线处出现红色条带，表明检测结果为阴性.因此，该试纸条灵敏度为1.0 ng/mL.

2.4 包被抗体浓度的确定

将cTnI稀释成50.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0 ng/mL标准溶液，进行检测，观察结果.

 

表2 不同浓度胶体金标记物的检测结果Tab.2 The detection results of colloidal gold with different concentrations

  

注：“-”表示阴性；“+”表示阳性，不同“+”数量表示不同阳性强度.

 

4030标记物浓度/%5020标本0 ng/mL 1.0 ng/mL 50.0 ng/mL质控带（兔抗鼠IgG）-±-+-+-+++++++++++++++++++++++++++++++

 

表3 不同包被浓度的检测结果Tab.3 The detection results of different coating concentrations

  

注：“-”表示阴性；“+”表示阳性，不同“+”数量表示不同阳性强度.

 

标本0 ng/mL 1 ng/mL 50 ng/mL质控带（兔抗鼠IgG）包被浓度/（mg·mL-1）0.5--+ ±1-±2-+3-+4-+5-++++++++++++++++++++++++++++++++++

2.5 胶体金免疫层析试纸条的特异性

用cTnI试纸条分别对2.5 mg/mL血红蛋白、8 mg/mL胆固醇、cTnT、cTnC进行检测，重复3次的结果均为阴性.

2.6 胶体金免疫层析试纸条的灵敏性

分别将100 mL胶体金标记单抗3C9制备的胶体金标记沉淀物用pH 7.0，浓度为 0.01 mol/L PBS-2%BSA溶液溶解稀释为50 mL（原体积的50%）、40 mL（原体积的40%）、30 mL（原体积的30%）、20 mL（原体积的20%），分别按0.1 mL/cm2的用量分散到玻璃纤维上，干燥后与同一批包被膜装配成试纸条，测试结果如表2，结果表明，采用原体积的40%的胶体金溶液制备成的胶体金标记物即可满足测试要求.

2.7 胶体金免疫层析试纸条的稳定性

将试纸条置2～8℃干燥条件下保存，每月定期抽检至第13个月，与新制备的试纸条平行检测阳性和阴性，均未发现特异性和敏感性降低.

2.8 胶体金免疫层析试纸条的精密性

用10.0 ng/mL的cTnI质控品平行检测10份胶体金免疫试纸条，反应结果一致，显色均一.

2.9 临床考核

用本实验室研制的cTnI胶体金免疫层析试纸条和美国贝克曼公司生产的化学发光免疫分析法试剂盒进行对比检测63份血清标本，其中阳性标本38份，阴性标本25份，阳性符合率为97.4%，阴性符合率为100%，具体数据见表4.

自2012年国内磷复肥表观消费量达到峰值以来，中国磷复肥行业开始进入供给侧结构性改革的大周期，行业发展从量的充足向质的提升转型。面对问题与困难，国内磷复肥企业积极去产能、调结构、提高核心竞争力，不断培育新的增长点，着重发展适应农业发展需求的差异化、环保高效的新型肥料，线上线下并举持续推动服务下沉，逐步缓解了产能过剩的压力，促进了化肥供需平衡，推动了国内市场的理性成熟，使行业技术水平更上层楼，盈利能力整体回暖。

那是天葬刀。刀身长一尺六寸，宽一寸六分，刃薄如蝉翼，锋红如泣血。刀柄处，一颗墨玉般的骷髅，将刀锋的尾端衔在口中。两眶中镶嵌着的红色双瞳，在天葬师伸手握住刀柄的刹那，闪烁起血色的光芒。

④混凝土充灌过程中，施工人员应注意保持模袋布的平整，拔管时带出的混凝土应立刻用自来水冲掉，保证模袋布的表面洁净。

 

表4 胶体金试纸条与化学发光免疫分析法对比Tab.4 Comparison with GICA and CLIA

  

胶体金试纸条阳性值阴性值总计化学发光免疫分析法阳性值37 1 38阴性值0 25 25总计37 26 63

3 讨论

cTnI是心肌受到损害后重要的判断指标，作为心肌损伤的标志物，对心肌梗死等疾病的诊断和术后预测具有重要应用价值［16］.胶体金免疫层析试纸条是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的检测技术［17］，跟化学发光免疫分析法、酶联免疫分析法和放射免疫分析法等相比具有独特的优越性［18］：无污染，操作简单，不需要复杂的仪器设备；检测迅速，一般不超过10 min［19］；由于检测时间相对较短，所以在灵敏度方面稍有欠缺，可以作为心肌梗死等现场样品的快速辅助检测.

本研究建立的cTnI胶体金免疫层析试验，利用本单位细胞室研制生产的高特异性和高亲和力的鼠源抗cTnI单克隆抗体和兔抗鼠IgG［20］，方法简便、快速，特异性和灵敏度好，最低检出量为1.0 ng/mL，适用于心肌梗死的早期快速检测及科研工作需要.

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