国兰通常指兰属（Cymbidium）植物中具有较高观赏价值的地生种兰花，包括春兰（C.goeringii）、建兰（C.ensifolium）、蕙兰（C.faberi）、寒兰（C.kanran）、墨兰（C.sinense）、莲瓣兰（Ctortisepalum）和春剑（C.tortisepalum var.longibracteatum）7个种类。兰花香味清幽，花色淡雅，素有“花中君子”的美称，观赏价值、经济价值和文化价值都非常高，深受人们喜爱[1]。

由于兰花种子极小且在自然条件下萌芽率极低，主要是通过分株进行繁殖。兰花每年产生的新芽较少，分株繁殖系数低，而且速度较慢，无法满足日益增长的市场需求。因此，组织培养技术成为国兰生产中行之有效的快速繁殖方法。目前，我国部分兰花试管苗及温室大棚苗的产业化发展已初具规模，组培快繁的市场应用也正在全国各省市迅速发展[2-3]。据相关统计，已有66属兰科植物通过组织培养方法进行繁殖，大大缩短了兰花的生长周期，有效保护兰属植物种质资源，特别是珍贵濒危的品种。虽然大部分兰花组培快繁技术较为成熟，但是组织培养中还存在一些尚未彻底解决的问题，如外植体污染和玻璃化、褐化等，尤其外植体污染已成为国兰组培是否成功的关键所在。研究以湖南本土国兰不同部位的外植体为材料，通过对组织培养过程中消毒剂、时间、消毒方法的不同搭配设计了6个消毒方案，以期找出适宜不同部位外植体的有效消毒方法，为国兰的快速繁殖技术提供参考。

如表1所示，实施分层护理管理后基础护理合格率、病房管理合格率、专业考核合格率及患者满意度均高于实施前，而护理不良事件发生率低于实施前，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验在湖南省农业生物辐照工程技术研究中心组织培养研究室进行。试验材料为蕙兰种子和湖南本土下山春兰新芽（选取完好无损、无病虫害、带基部的健康新芽）。供试消毒剂有乙醇、升汞、次氯酸钠，均购自长沙隆和化玻实验用品有限公司。

风影作别父母，提前回到了白云寺。师父感到非常奇怪，离开寺庙是风影求之不得的事，这次破天荒地放三天假，让他回家探望双亲，已经是法外开恩了，照理风影是梦寐以求的，他就像放鸟出笼一样，暂时恢复自由的风影，可以与久别重逢的父母难得的团聚数日，他在父母身边多呆一刻也是好的，可风影为什么一反常态，会提前一日回到寺院里呢？

1.2 试验方法

目前，针对兰花组织培养技术的报道较多，于永畅等[6]研究了以国兰根尖、茎尖为组培外植体时的消毒方法，认为用75%乙醇浸泡30 s后，在10%次氯酸钠中消毒20 min既能有效降低外植体污染率，又能保持较高成活率。而笔者的试验结果表明，蕙兰种子组织培养采用75%乙醇45 s +0.1%升汞消毒8 min的效果较佳，75%乙醇45 s +0.1%升汞消毒5 min对春兰新芽组培的灭菌效果较好。不同外植体的耐消毒剂能力不一样，因此对国兰组培外植体的消毒还要根据外植体不同选择合适的消毒方法，以提高外植体的成活率。此外，试验结果还表明，升汞的消毒效果总体优于次氯酸钠，但需要掌握消毒时间，以免消毒过度对外植体造成伤害导致其死亡。先用乙醇进行较为温和的处理，可减少次氯酸钠、升汞的处理时间，尽可能的减少外植体的死亡。

1.3 数据处理

国兰组织培养中比较棘手的问题就是外植体的污染，通常是微生物（细菌、霉菌、病毒）污染，这是影响兰花组培苗成功出苗的重要指标之一[4]。在兰花组培过程中，多数为细菌污染，占总污染量的80%以上。细菌污染包括内生细菌污染、外生细菌污染。通常培养基、接种工具、外植体材料、接种员工违反操作规程等是外生细菌的主要来源，有人认为可能由于器具消毒不彻底，常带有半致死性细菌构成组培中较常见的细菌性潜在污染；而内生细菌污染情况相对比较复杂，外植体材料本身可能携带细菌，因此在组织培养过程中选择适宜的外植体材料、采用适宜的灭菌方法显得尤为重要[5]。

喘振控制主要包括控制最小流量、控制最大压力、控制压缩比与实际流量的关系。喘振控制模型通常采用压缩比与实际流量的关系。这个模型的优点在于能够提供准确的喘振预测，同时气体组分的变换对喘振线的形状和位置几乎没有什么影响，这样就能维持喘振控制点和实际喘振点之间的安全余量在一个比较稳定的范围内，避免操作过程中因气体组分发生变化使操作越过喘振安全余量区而导致喘振发生。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂处理对蕙兰种子消毒的效果

[1] 李子红，贾 燕. 珍品兰花快速繁殖与养护[M]. 上海：上海科学技术出版社，2006.

爱读书的人对书总有特殊的感情。古往今来，热爱读书的人不计其数，对读书的说法也有种种，列宁说“书籍是巨大的力量”，高尔基说“书籍是人类进步的阶梯”，陈寿说“一日无书，万事荒废”，孟子则说“尽信书，则不如无书”。

 

表1 不同消毒剂处理下蕙兰种子污染率的比较

  

处 理 接种时间（月-日）接种数量（瓶） 污染数（瓶）污染率（%）1 06-20 20 5 25 2 06-20 20 3 15 3 06-20 20 2 10 4 06-20 20 8 40 5 06-20 20 5 25 6 06-20 20 3 15

2.2 不同消毒剂处理对春兰新芽消毒的效果

实验前小鼠体质量符合正态分布(表1)，差异无统计学意义(W=0.94，P=0.10)，随实验进行各组小鼠体质量逐渐增长，至实验结束时(d13)重组人血管内皮抑素+DDP(d4～d6)组小鼠体质量增长最慢，但各组间体质量差异无统计学意义。对小鼠体质量资料进行方差分析，小鼠体质量符合球形检验(F=0.19，P=0.19)，分组因素主效应方差分析，F=3.53，P=0.15，时间因素主效应方差分析，F=0.05，P=0.82，时间因素与分组因素交互效应方差分析，F=3.30，P=0.21。

 

表2 不同消毒剂处理下春兰新芽污染率的比较

  

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3 结论与讨论

试验数据采用Microsoft Excel 软件进行数据处理。

通过文献查阅，选用3种消毒试剂，分别是10%次氯酸钠、0.1%升汞、75%乙醇，设置不同的消毒时间，共6个消毒试验组合，分别为：处理1，75%乙醇45 s+0.1%升汞3 min；处理2，75%乙醇45 s +0.1%升汞5 min；处理3，75%乙醇45 s +0.1%升汞8 min；处理4，75%乙醇45 s +10%次氯酸钠10 min；处理5，75%乙醇45 s +10%次氯酸钠15 min；处理6，75%乙醇45 s +10%次氯酸钠20 min。外植体置于封闭容器中，分别将取得的种子和新芽按不同方法消毒后，用无菌水冲洗6～8次，然后接种于含有MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+活性炭2.0 g/L的培养基中；以种子作外植体时，每个蒴果接种10瓶，每瓶约500颗种子；以新芽为外植体时，每瓶接种1个新芽小段，每处理接种20瓶。15 d后统计污染情况。在光照强度2 000 Lx、光照时间12 h/d的条件下培养。

参考文献：

国兰组织培养过程中受污染的概率较高，如何降低污染率，首先杀菌剂的选择要适宜、消毒方法要正确，其次还要从其他各个操作过程中杜绝污染的发生。比如增加对接种工具及培养器皿的高压灭菌时间；做好超净工作台和接种室的灭菌工作；尽量选取洁净、无病虫害、生长能力较强且不带或少带内生菌的材料为外植体；接种过程中严格遵守接种操作规程；在培养基内加入适量经过滤杀菌后的抗生素，可以有效降低外植体的污染率。

从表2可以看出，0.1%升汞消毒时间分别为3、5、8 min，新芽污染率分别为40%、25%、15%，死亡率分别为40%、45%、65%，产生愈伤的新芽数量分别为2、3、1。这表明随着处理时间的延长，0.1%升汞溶液对春兰新芽的消毒效果越好，但与其对种子的消毒效果相比稍差一些，最高污染率为40%，最低为15%；同时，随着消毒时间的延长，新芽的死亡率升高，最高达65%，原因可能是升汞毒性较大，当处理时间过长或冲洗不彻底时会造成外植体的死亡。10%次氯酸钠的消毒时间为10、15、20 min，新芽污染率分别为55%、30%、25%，死亡率为60%、45%、60%。由此可知，10%次氯酸钠对春兰新芽消毒效果与0.1%升汞溶液消毒效果相似，即灭菌时间增加，污染率降低，但死亡率升高。整体来看，各处理的愈伤组织生长情况均不理想，出愈率低，原因可能是生长激素和细胞分裂素的浓度不适宜，同时诱导时间不够导致的。综合来看，以75%酒精45 s+0.1%升汞消毒5 min对春兰新芽组培灭菌效果相对较好。

由表1可知，0.1%升汞消毒时间为3、5、8 min，种子污染率分别为25%、15%、10%，表明采用0.1%升汞溶液对蕙兰种子消毒，随着灭菌时间的增加，污染率逐渐降低，效果较理想；10%次氯酸钠的消毒时间为10、15、20 min，种子污染率分别为40%、25%、15%，表明10%次氯酸钠对兰花种子消毒效果与0.1%升汞溶液的趋势相似，都是随着处理时间的延长，消毒效果越好，污染率越低，但0.1%升汞溶液对蕙兰种子的消毒效果要优于10%次氯酸钠。由于种子的萌发时间较长，检测污染率时种子尚未萌发，因此未测出种子的死亡率。从以上结果分析可知，蕙兰种子组织培养中宜采用75%酒精45 s+0.1%升汞消毒8 min的消毒方式。

[2] 陈进勇，程金水，朱 滢. 几种中国兰种子试管培养根状茎发生的研究[J]. 北京林业大学学报，1998，20（1）：32-35.

[3] 丁燕芬，王 岩，龙春林. 中国兰花组织培养研究进展[J]. 安徽农业科学，2007，35（8）：2247-2248，2250.

[4] 陈少珍，卜朝阳，闭志强，等. 兰花组织培养中常见问题及解决方法[J]. 广西农业科学，2006，37（1）：73-74.

[5] 熊 丽，吴丽芳. 观赏花卉的组织培养与大规模生产（第1版）[M].北京：化学工业出版社，2003.81.

[6] 于永畅，张安琪，聂 硕，等. 国兰组织培养中外植体消毒试验研究 [J]. 山东林业科技，2013， 43（5）：55-57.