膝骨关节炎(KOA)是一种进行性关节退变疾病，严重危害中老年人健康，已被列为全球第四大致残因素[1]。膝骨关节炎发病机制复杂，多种细胞因子、信号通路参与了这一过程，多致病因素导致软骨首先发生变性，局灶性软化，失去正常弹性，表面粗糙，局部小凹陷、脱落等；其次是骨糜烂，脱落后软骨下骨板暴露；第三是轻度的滑膜炎。研究证实，磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB)信号途径(PI3K/AKt途径)是一条经典的抗凋亡通路，发挥了快速从膜到核的信号转导作用，并且其下游通路Bad、Caspase和NF-кB都是抗骨关节炎软骨凋亡的重要通路[2]。研究表明，PI3K/AKt信号通路参与多种细胞增殖、凋亡及分化调节，该通路是调控软骨细胞增殖、凋亡以及基质重塑最重要的通路之一[3]，在软骨细胞凋亡过程中发挥着突出作用，在骨关节炎早期PI3K/AKt信号通路即通过各种方式被激活[4]。本文通过病理组织学及蛋白水平的实验研究方法，观察了骨痹方对KOA大鼠膝关节软骨细胞PI3K/AKt信号通路及膝关节滑膜病理组织形态学的影响。

1 材料和方法

1.1 动物与实验药品

选取SD大鼠(SPF级,体质量200～250 g)56只，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物生产许可证：SXCC(京)2012-0001。实验动物的处置严格遵守实验动物管理与保护的有关规定。实验动物于南京中医药大学动物实验中心清洁级饲养室饲养，自由饮水和摄食。饲养室温度24～25 ℃，相对温度7%左右。

骨痹方由鸡血藤、桑寄生、骨碎补、怀牛膝、川断、油松节、千年健、土鳖虫8味药物组成。

（2）冬小麦和夏玉米籽粒OP、BPA和NP质量分数分别为 0.77~25.33、1.36~543.67和140.39~446.16 μg·kg-1，果蔬 OP、BPA 和 NP 质量分数分别为 11.39~204.53、93.42~893.86和220.33~392.07 μg·kg-1，均以 BPA 和 NP 含量为主。参考欧盟和丹麦提出的人体可耐受每日摄入量，本研究中农产品BPA和NP含量均低于相应参考限值。

硫酸氨基葡萄糖胶囊(维固力)，规格：每粒为0.25 g，罗达药厂生产。

了空法师到底是个明察秋毫的人，见风影情绪低落，光着一双脚，有一搭没一搭地在院落里清扫落叶，也就没有多问。风影依然一下一下地扫着，像是要将满心的烦恼连同莫名的忧伤一起扫掉，他看上去长高了许多，也比三年前成熟多了。不管是光还是影，带来的终究不过是一种穿越了生死场的恍惚。人生如梦，说的是活着只是一个梦，死了梦就醒了。

1.2 主要试剂与仪器

2007年无锡供水危机后，国家下决心进一步治理太湖，2008年出台了《太湖流域水环境综合治理总体方案》，以减污治污为中心，以节水调水为手段，工程措施与社会管理相结合，对太湖流域进行综合治理和管理。《条例》明确太湖流域管理应当遵循全面规划、统筹兼顾、保护优先、兴利除害、综合治理、科学发展的原则，并赋予了太湖局统筹协调、监督和管理职责。

从图2可见，模型组调控软骨细胞凋亡的PI3K/AKt信号通路途径的下游因子AKt及下游靶蛋白Bcl-2表达低于正常组，骨痹方高剂量组AKt表达量显著高于正常组(P<0.01),骨痹方中剂量组AKt表达量与正常组接近；与模型组比较，骨痹方高剂量组AKt表达量及下游靶蛋白Bcl-2显著升高(P<0.01)，Bax表达降低；与阳性药组相比，骨痹方中剂量组AKt及下游靶蛋白Bcl-2蛋白表达量略高，Bax蛋白表达量显著升高。结果表明，骨痹方能够促进PI3K/AKt信号通路途径下游因子AKt的表达，降低Bax表达，增强下游靶蛋白Bcl-2活化，继而使软骨细胞存活；骨痹方可能是依靠促进PI3K/AKt信号通路激活，发挥其抗细胞凋亡作用。

细胞培养血清购自Gibco公司，抗体购自CST公司，Ⅱ型胶原酶购自AngleGene公司，0.9%生理盐水，戊巴比妥钠，磷酸缓冲液(PBS)，青霉素等。

1.3 动物造模与分组

采用手术方式(改良Hulth's法)复制大鼠KOA模型，具体手术方法如下：使用2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定于鼠板上，常规消毒、铺单，统一选择大鼠右膝关节内侧入路并作一长约1 cm切口，先剪断内侧副韧带，充分暴露关节腔，再离断前后交叉韧带，最后完全摘除内侧半月板，进行抽屉试验验证造模是否成功，造模成功后逐层缝合并无菌包扎，术毕。术后右膝患肢不予固定，保证其可自由地活动。术后连续1周予各组KOA模型大鼠8×104U青霉素(1 mL/kg)腹腔注射，预防感染治疗。注射治疗1周后，需每日驱赶迫使KOA模型大鼠活动1次，时长不少于30 min，共8周[5-6]。另假手术组只需切开关节囊并无菌包扎固定即可，正常组不处理。

数据均采用SPSS19.0统计学软件分析，计量资料以描述，组间比较采用单因素方差分析处理，计数资料比较采用χ2检验，数据结果分布情况不符合正态分布的采用秩和检验，均以P<0.05表示有统计学意义。

1.6.2 Western blot检测PI3K/Akt信号通路AKt及其下游靶蛋白Bax、Bcl-2的表达 用RIPA裂解液裂解对已充分研磨的软骨组织进行匀浆提取蛋白后，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性制成上样液后，每组取30 μL上样液在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，时间为1.5 h左右。完毕后采用湿转法将蛋白电转移到聚偏氟乙稀膜上，用50 g/L的脱脂奶粉室温封闭1 h后，再加入相应的特异性一抗4 ℃冰箱孵育过夜，后使用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min左右，洗膜后再加入相应辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃摇床孵育2 h后TBST漂洗3次，每次10 min左右，最后使用ECL工作液在X片上显影、定影。扫描胶片，保存结果条带，使用Image J软件测定吸条带光度值。结果分析采用目的条带/内参条带( -actin) 的灰度值之比代表蛋白的相对表达量。。

1.4 软骨细胞培养

无菌条件下关节软骨剪碎后，加入含10%胎牛血清、0.5 mg/mLⅡ型胶原酶、0.5 mg/mL链酶蛋白酶E的DMEM中，在37 ℃摇床消化过夜，细胞悬液经70 μm孔径的尼龙过滤器过滤、洗涤、计数后，在37 ℃的二氧化碳孵箱内用含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酸钠、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM中培养，并采用Ⅰ型胶原包被的培养皿。

1.5 细胞处理及标本采集

采用血清药理学通法制备骨痹方含药血清。选健康SD大鼠，体质量260～300 g，以骨痹方每天给药(给药量为正常用药的4倍)2次进行灌胃，连续给药3 d，末次给药后1 h采血，13 000 r/min离心10 min分离制备含药血清，4 ℃保存备用。以生理盐水灌胃处理实验大鼠制备对照血清。

当细胞长到80%时，以含骨痹方含药血清的DMEM培养基和对照血清分别处理细胞0、4、8、12、16、24 h，收集细胞加入细胞裂解液处理抽提总蛋白。

2.1.1 膝关节滑膜组织HE染色切片的观察 从图1可以看出，正常组大鼠膝关节滑膜细胞连续平整排列、分布层次清晰，无细胞肿胀、组织坏死及炎细胞浸润情况发生。假手术组大致表现与正常组接近，滑膜细胞排列连续平整、结构层次清晰，可见血管轻微充血，无滑膜细胞肿胀、组织坏死及炎细胞浸润情况发生。与正常组、假手术组相比，模型组大鼠的膝关节滑膜可见不同程度的充血水肿，伴有滑膜细胞明显肿胀、大量炎细胞浸润及组织坏死情况发生。而治疗后的阳性药组大鼠膝关节滑膜可见轻度水肿，滑膜细胞轻度增生肿胀，未见组织坏死发生，较模型组病理变化有改善。骨痹方高剂量组大鼠膝关节滑膜可见轻度充血水肿，滑膜细胞轻度增生，少量炎细胞浸润，未见组织坏死。骨痹方中剂量组大鼠膝关节滑膜充血水肿情况表现为轻度，滑膜肿胀，并可见少量炎细胞浸润，无组织坏死情况发生。骨痹方低剂量组大鼠膝关节滑膜可见充血水肿情况呈中度，滑膜细胞轻度增生，滑膜肿胀，并可见少量炎细胞浸润，未见组织坏死。见图1。

1.6 实验指标检测

1.6.1 组织形态学观察 使用CKX41型倒置式生物显微镜对已通过HE染色的膝关节滑膜组织病理切片进行观察，主要观察指标为血管充血情况、滑膜组织肿胀情况、炎细胞浸润情况及滑膜组织坏死情况等病理变化，并根据相关评分标准进行评分，具体见表1。

用于监测监控隐患的各类传感器，布设在地质灾害隐患区域，获取的监测、影像信息需要持续、不间断地传输至监控中心，监控中心也要发送操控命令给传感器。监测监控物联网的网络层承担信息双向传输，是整个物联网运行的基础，既要保障传输能力，还要保证稳定可靠。

 

表1 病理组织学评分标准

  

病变程度评分正常(-)0轻度(+)1中度(++)2重度(+++)3

遵循临床研究验证后确定的有效剂量，同时以体质量与体表面积换算的方法为依据，参考Meeh-Rubner氏公式，进而计算大鼠的给药剂量。计算公式：大鼠所需药物剂量=人所需药物剂量×0.47(人体表面积)/0.08(大鼠体表面积)。阳性对照组用硫酸氨基葡萄糖配制为0.017 g/kg溶液，骨痹方低剂量组、中剂量组和高剂量组分别为6.05、12.1、24.2 g/kg的骨痹方水煎剂。正常组、模型组分别予等体积生理盐水。各组每日灌胃1次，连续8周。

1.7 实验数据分析处理

选取40只SD大鼠成功造模后，随机分为以下5个组别：模型组、阳性药组(维固力组)、骨痹方高剂量组、骨痹方中剂量组及骨痹方低剂量组(n=8)；另选取假手术组(n=8)和未予处理的正常组(n=8)。

2 结果

2.1 大鼠膝骨关节炎滑膜组织形态学观察

病理观察标本取各组大鼠右侧股骨内踝关节滑膜组织，使用10%甲醛溶液固定，将滑膜组织经常规石蜡包埋、切片(厚度为5～6 μm)，使用HE染色后观察。

丰田公司知识链的构建，使丰田公司、供应商、专家顾问等都获得了有价值的知识。供应商可以通过咨询交流的方式从专家顾问那里获得有价值的知识，也可以通过与其他供应商合作的方式获得知识提升。丰田公司在与供应商合作的过程中，不仅能从供应商那里学到有价值的知识，还可将有价值的知识传递到公司内部和其他的供应商，进而使得整个知识链能够源源不断地产生有价值的知识。换句话说，在“丰田公司—供应商—专家顾问”知识链中纵向的竞争关系和横向的协作关系的作用下，知识链中各主体间最终可形成一种协同共生的关系。同时，由于知识链间的竞争和协作能够促进新知识的产生，故基于知识链的协同共生，能够提升整体知识的价值并形成知识优势。

施工质量会直接影响到路面的压实度，需有效控制好路面碾压及摊铺工程中的工艺。工作人员需确定出各有效指标并满足制定形式的要求。除此之外，碾压的速度和力度更应严格控制。另外，碾压工作涉及众多因素，工作人员需从根本上分析影响因素并确定好碾压工作程序，最终保证在施工中，压实度可符合其具体要求。在实际工作中，对摊铺机的力度也有要求，所以为了能够保证碾压程序有效化，需制定出有效的处理方式，以当前规范形式为基准，加强重视起碾压工艺。依据已有的规范标准，保证碾压工作的有序性，及时控制好各项干预程序[5]。

  

正常组

  

模型组

  

假手术组

 

阳性药组

  

骨痹方低剂量组

  

骨痹方中剂量组

 

骨痹方高剂量组

图1 各组大鼠膝关节滑膜HE染色图片(×200)

2.1.2 膝关节滑膜病理组织学检查评分 模型组大鼠膝关节滑膜组织形态学评分较正常组显著增高(P<0.01)；而骨痹方中、高剂量组大鼠膝关节滑膜损伤评分较模型组损失评分均有明显下降(P<0.05)。见表2。

 

表2 骨痹方大鼠膝关节滑膜组织形态学评分

  

组别n组织形态学评分正常组80模型组89．44±1．21∗∗假手术组80阳性药组(0．017g/kg)84．21±1．79##骨痹方低剂量组(6．05g/kg)810．01±1．78骨痹方中剂量组(12．1g/kg)77．63±1．91#骨痹方高剂量组(24．2g/kg)87．56±1．75#

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 KOA大鼠软骨细胞PI3K/Akt信号通路AKt及其下游靶蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表达

见图2。

  

图2 PI3K/Akt信号通路AKt及其下游靶蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表达

CKX41型倒置式生物显微镜，日本Olympus公司；EnSpire型酶标仪，美国PerkinElmer公司；5417R型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；超低温冰箱、CO2培养箱，Thermo SON Tific公司；垂直流超净工作台、生物安全柜，ESCO公司；电转仪、电泳仪，美国Bio-Rad公司。

3 讨论

骨痹方是国医大师周仲瑛教授治疗KOA的经验方，周老认为KOA的病机是因患者年高体虚，正气亏虚，肝肾精血不足，复感风寒湿邪，痹阻经脉，痰浊和瘀血凝滞于关节筋骨而成，故确立补肾养血，蠲痹通络为其治疗大法。骨痹方是由鸡血藤、桑寄生、骨碎补、怀牛膝、川断、油松节、千年健、土鳖虫等8味药材组成，鸡血藤、桑寄生二者共为君药，奏益肾养血，强壮筋骨之效；骨碎补、怀牛膝、川断共为臣药，增强君药益肝肾、强筋骨之功；油松节、千年健共为佐药祛风湿、通经络；土鳖虫搜风通络，能使诸药达其病所，故为使药。

3.1 骨痹方对KOA大鼠膝关节滑膜组织形态学的影响

实验结果显示，假手术组大致表现与正常组接近，滑膜细胞排列连续平整、结构层次清晰，可见血管轻微充血水肿，无滑膜细胞肿胀、组织坏死及炎细胞浸润情况发生；而造模8周后模型组KOA大鼠滑膜可见不同程度的充血水肿，伴随着滑膜肿胀、炎细胞浸润及组织坏死等表现；使用骨痹方干预后可见大鼠膝关节滑膜病理表现有所改善，血管呈轻度充血水肿，滑膜细胞轻度增生，未见组织坏死，说明骨痹方治疗KOA疗效确切，但具体机制不明。

3.2 骨痹方对KOA大鼠软骨细胞PI3K/Akt信号通路AKt及其下游靶蛋白Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

PI3K/AKt是一种丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，在细胞分化、增殖、凋亡及葡萄糖转运等多种细胞转录和迁移过程中发挥至关重要的作用。人类基因中AKt家族是由AKt、AKt2及AKt3组成。AKt与多种癌症的发生相关，通过下游多途径使靶细胞磷酸化而发挥参与细胞的生存途径、抗细胞凋亡的过程[7]。AKt2是一个主要调节葡萄糖转运的胰岛素受体信号通路[8]。AKt3作用机制研究较少，有研究显示使用AKt3抑制剂的小鼠会发生脑萎缩，从而推测AKt3的表达主要在脑部[9]。本文主要是对经典的抗凋亡通路PI3K/AKt信号通路中的AKt及其下游靶蛋白Bcl-2等进行研究。

由图5可知：对于预制裂纹花岗岩仅在失稳破坏阶段接收到了较大的电荷感应信号和微震信号，信号幅值分别达到最大值50pC和6×10-3 m/s，而在失稳破坏阶段前无明显的电荷感应和微震信号。

软骨细胞凋亡是一个多种细胞信号转导通路参与的复杂的病理过程，各种细胞信号转导途径并非各自独立、互不相干，而是纵横交错、相互影响，构成一个复杂的细胞信号通路网络，共同介导软骨细胞凋亡的病理过程，虽然每条细胞信号传导通路的作用细节尚未完全阐明，但可以肯定的是其中的PI3K/AKt信号转导通路已被公认是抗软骨细胞凋亡的重要通路[10]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,，多种细胞因子和信号传导复合物均将其激活，从而直接或者间接激活下游因子AKt[11]。AKt负责由PI3K始动的生物信息的传导，参与蛋白合成、抗细胞凋亡、阻断溶细胞质、葡萄糖转运等过程。AKt的抗细胞凋亡机制主要是由以下3条途径实现:通过XIAP因子发挥抗细胞凋亡作用[12];抑制Bax、Bcl-2、Bim及Fox01的致细胞程序性死亡作用[13]，阻断Bad的溶细胞质作用[13]。研究表明[14],细胞外多种细胞因子和信号传导复合物使受体氨酸激酶(RTK)激活，引起自磷酸化。此时，PI3K通过P85亚单位的SH2(src同源序列2)停泊，引起自身P110亚单位活性变构调节而被激活。活化的PI3K会催化自磷酸化而产生PIP2和PIP3，二者均为细胞内的第二信使[15-16]。简而言之，通过PI3K和PDK(磷酸肌醇依赖性蛋白激酶)的激活，使Akt转位到膜上被活化，激活的Akt返回细胞质，磷酸化其下游靶蛋白Bcl-2(B细胞淋巴瘤-2)家族成员死亡促进因子Bax，抑制Bax蛋白活性，促进Bcl-2活化，从而使细胞存活。

在本研究中观察到模型组调控软骨细胞凋亡的PI3K/AKt信号通路途径的下游因子AKt及下游靶蛋白Bcl-2表达低于正常组，说明在KOA模型大鼠中PI3K/AKt途径被抑制。骨痹方高、中剂量组AKt表达均高于模型组，说明经骨痹方干预后软骨细胞AKt的活化程度较模型组增高，且骨痹方高剂量组AKt表达量高于阳性药组，更进一步说明骨痹方治疗KOA有一定实用价值。

骨痹方在本研究中显示是能够增强AKt活化程度，降低Bax表达，增强下游靶蛋白Bcl-2活化，因此推测骨痹方具有保护KOA大鼠软骨细胞功能，一定程度地改善膝骨关节炎病理组织形态学，其作用机制可能与其干预KOA大鼠软骨细胞PI3K/AKt信号通路的激活并提高AKt活化程度有关。

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