近年来乳腺癌在女性中的发生率正逐年上升。尽管化放疗技术的发展有效降低了该疾病的死亡率，但乳腺癌的转移和复发仍是当前临床面临的最具挑战性的难题。泽泻为泽泻科植物，是一种常用的传统中药，其作为利尿药和降血脂药物，已有上千年的历史[1-3]。泽泻中许多萜类化合物的药理活性已有相关报道，如抗过敏[4]、抗肿瘤[5-7]以及抗炎[3]等。泽泻醇B为泽泻中主要的化学成分之一，其抗肿瘤活性已有相关报道[8-9]，可能与诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期以及促进细胞内ROS水平有关。本文以4T1乳腺癌细胞为体外模型，研究泽泻醇B对乳腺癌细胞转移的抑制作用，探讨该化合物在乳腺癌治疗中的应用价值。

这种通过努力工作寻求宗教救赎的新教世俗化转向，不仅构成了西方资本主义的思想基础，使资本主义成为可能，它也是世俗慈善事业脱离宗教慈善事业的思想基础，从而为科学的慈善，为社会工作的产生和发展提供了可能性。因而它自然也是增能取向的社会工作或社会工作的增能理论的重要思想基础之一。

综上所述，经过几年来种植经验，福鼎四季柚栽培要从合理选地、培育壮苗、施足基肥、疏枝修剪、疏花疏果，加强肥水和病虫害管理，才能获得优质丰产的目的。

1 材料

泽泻醇B(MedChemExpress公司，批号：HY-N0805A)；MTT试剂(美国Sigma公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：12491-015)；胎牛血清(杭州四季青，批号：11012-8611)；Transwell小室(美国Costar公司)；基质胶(美国Costar公司，批号：356234)；抗体MMP-9(13667)、MMP-2(87809)、-actin(D6A8,8457)和二抗(美国Cell Signaling Technologies公司)。酶标仪、垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)；化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)；细胞成像多功能检测系统、正置显微镜(日本Nikon)。

2 方法

2.1 细胞培养

4T1乳腺癌细胞株在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养(100 U/mL青霉素，75 U/mL链霉素)。培养条件：37 ℃，5%CO2。待细胞达到80%满，用0.25%胰酶消化(AMRESCO，PBS溶解，pH=7.4)，计数，按照一定密度接种。

2.2 细胞活性检测

10 μmol/L泽泻醇B作用细胞24 h后，消化收集细胞，计数，置1%胎牛血清的培养基中吹打均匀。将细胞接种于预孵基质胶(5 μg/室)的24孔板Transwell小室的上室中，每孔细胞数2×105个，每组3个复孔。24孔板内加入含10%胎牛血清的培养基。24 h后，取出小室，用棉签擦掉上室里面未转移的细胞，甲醇固定，HE染色，清水冲洗，并将之封片。在10×显微镜下随机取5个视野，进行细胞计数并统计结果。

2.3 细胞划痕试验检测细胞迁移能力

将对数生长期的细胞以每孔3×105的密度接种于24孔板内，培养箱内37 ℃培养过夜。待细胞生长融合后用1 000 μL移液器枪头垂直划痕，制作划痕伤口模型。分别于加药前后(0 h与24 h)拍照，每孔拍3处。用ImageJ软件测量记录0、24 h的划痕宽度，求平均值。

2.4 Transwell小室检测细胞侵袭能力

取对数生长期细胞，以每孔2×104的密度接种于96孔板中，贴壁6 h，随后细胞以不同浓度的泽泻醇B或空白溶剂(1%DMSO)作用24 h。加入MTT试剂，终浓度为0.5 mg/mL。4 h以后，弃除上清，加入100 μL DMSO，96孔板用微型振荡器涡旋3 min。490 nm条件下用酶标仪检测吸光度。

2.5 Western blot检测蛋白质表达水平

如图3所示，10 μmol/L泽泻醇B作用细胞24 h后，细胞侵袭能力明显下降，其相对侵袭率降至(47.06±9.32)%(P<0.01)。

2.6 统计学分析

如图4所示，10 μmol/L泽泻醇B作用细胞24 h后，细胞内MMP-2及MMP-9的蛋白表达水平显著下调。

3 结果

3.1 泽泻醇B对4T1细胞活性的影响

如图2所示，细胞经10 μmol/L泽泻醇B作用24 h后，细胞迁移能力明显下降，其相对迁移率降至(52.66±8.48)%(P<0.01)。

乳腺癌细胞的特异性、转移器官微环境以及二者之间的相互作用是乳腺肿瘤转移的重要因素。癌细胞的转移已成为乳腺癌治疗过程中面临的最大难题。传统中药由于其良好的抗肿瘤作用和较低的毒性，为新的抗肿瘤药物的开发提供了宝贵的资源[10]。近年来，中药泽泻中萜类化合物的抗肿瘤活性已受到越来越多研究者的关注。

  

图1 泽泻醇B对4T1细胞存活的影响

3.2 泽泻醇B对4T1细胞迁移能力的抑制作用

如图1所示,细胞经不同浓度的泽泻醇B作用24 h后，对细胞均具有一定的抑制作用，显示出良好的剂量依赖性。当药物浓度低于10 μmol/L时，未表现出显著的细胞毒作用；药物浓度为10 μmol/L时细胞存活率为(83.77±5.20)%。因此剂量10 μmol/L被用于随后的药物抗转移实验研究。

  

注：与对照组比较，**P<0.01。图2 泽泻醇B对4T1细胞迁移能力的抑制作用

3.3 泽泻醇B对4T1细胞侵袭能力的抑制作用

10 μmol/L泽泻醇B作用细胞24 h后，收集细胞，裂解液裂解，提取总蛋白。高速离心移除细胞碎片(12 000 r/ min，4 ℃，15 min)，测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白经SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜上。膜用含5%脱脂奶粉封闭2 h后，用一抗4 ℃孵育过夜。随后PBS洗膜3次，再用二抗在室温孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光试剂盒显影。

3.4 泽泻醇B对4T1细胞MMP-2及MMP-9表达水平的影响

所有数据采用表示。组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

  

注：与对照组比较，**P<0.01。图3 泽泻醇B对4T1细胞侵袭能力的抑制作用

  

图4 泽泻醇B对4T1细胞MMP-2及MMP-9蛋白表达水平的影响

4 讨论

电桥②在拉向载荷校准试验中，响应灵敏但线性相关性较差；在压向载荷校准试验中，响应灵敏且线性相关性较好。分析原因，是在拉向加载时，载荷主要从两侧缘条传向套筒，由于该处距离螺栓较近，受应力集中影响，电桥②位置受载不均匀，故响应灵敏但线性较差；压向加载中，载荷主要经耳片穿向套筒，故②电桥响应很灵敏，但受一定的应力集中影响，所以线性略差。

4T1细胞为鼠源乳腺癌细胞，具有极强的转移能力，在体内动物模型中，4T1细胞能够快速转移到各个脏器中，如肺、肝、脑、骨髓等部位。该模型与人乳腺癌模型高度相仿，被认为是与人Ⅳ期乳腺癌等同的动物模型，具有高效、快速转移的特点，该模型已被广泛用于乳腺癌转移的研究中。本研究以4T1细胞为体外模型，发现泽泻醇B对4T1细胞的侵袭和迁移具有显著的抑制作用。

传统的钨、钼加热炉只是在炉内通有保护氢气，在炉外没有保护，因此在高温材料从炉内取出时，因为炉膛内压力的降低，造成炉外空气进入炉内，增加的火封装置能够在炉口形成火帘，阻止空气进入炉内，保持炉内气氛稳定，同时避免爆炸。

肿瘤转移是一个复杂的过程，主要包括：癌细胞的脱离、细胞外基质的降解、进入循环系统、癌细胞随循环到达靶器官，继而在靶器官内增殖并形成转移灶[11]。研究证实MMP-2和MMP-9在肿瘤浸润和转移过程中发挥了重要作用，主要参与细胞外基质的降解[12]。本研究发现4T1细胞经泽泻醇B作用一定时间后，细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达量显著下降，表明泽泻醇B抑制4T1细胞的转移可能与抑制细胞内MMP-2与MMP-9的表达量有关。

总之，本研究证实泽泻醇B在体外具有良好的抗转移活性，且能有效抑制基质金属蛋白酶的活性。然而，其具体的作用机制还有待于深入的研究，该化合物在体内的抗转移作用也需进一步评价。

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