年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)分干性、湿性两类，其中干性者约占90%。干性AMD眼底主要表现为脉络膜毛细血管萎缩、玻璃膜疣以及视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelium，RPE)萎缩，晚期可发生黄斑区地图状萎缩，导致视力明显下降，还有部分干性AMD会进展为湿性AMD。湿性AMD近年因抗VEGF治疗取得较大进展，但干性AMD目前尚无确切有效的治疗措施。研究表明，核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路与AMD发病关系密切[1]，激活Nrf2通路可以诱导机体产生抗氧化酶和II相代谢酶，对氧化损伤ARPE-19细胞起到保护作用[2]。

本研究使用的补肾益气活血方是我们治疗干性AMD的经验方，为进一步提高临床疗效，我们参考国内外近年干性AMD研究进展，结合们干性AMD药物防治研究成果，对其进行了优化。本研究观察优化后的补肾益气活血方对干性AMD模型动物视网膜氧化损伤的保护作用，以及对Nrf2通路的影响，以探明作用机制，为临床应用提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

6月龄的雌性C57BL/6小鼠60只，体质量25～33 g，购自南京大学模式动物研究所，生产许可证号：SCXK(苏)2005-0002。

1.2 实验药物

补肾益气活血方由枸杞子、桑椹子、菟丝子、太子参、葛根、生山楂、槐花、黄芪、白术、茯苓、川芎、三七组成。中药饮片购自南京中医药大学附属医院，药物共同水提后，浓缩成含生药2 g/mL的流浸膏后4 ℃保存备用。阳性对照药物为乐盯，主要成份为叶黄素，维生素A，维生素C，维生素E，维生素B1，葡萄酸锌。每100 g含叶黄素1.51 g，维生素C3.06 g，锌0.8 g。0.5×60粒/瓶，广州市范乐医药科技有限公司生产。

直流侧不平衡故障时差动电流的幅值与接地电阻值的大小成反比；阻值越大入地差流越小，对设备及人身安全危害越小；但高电阻同时会降低直流配网中差动保护的灵敏度，甚至无法识别故障。

1.3 实验试剂

Fusion Diagnosis of the Combustion Stability Based on D-S Evidence Theory LIU Xiaohui，TIAN Liang(73)

1.4 实验仪器

Bio-Tek酶标仪(美国Synergy公司)，荧光定量PCR仪：CFX Real-Time System，电泳系统：Mini-Proten Tetra System，凝胶成像仪：ChemiDoc XRS+ System(美国Bio-RAD公司)，超薄切片机(美国POWERTOME XL)，透射电镜(美国FEI公司Tecnai G2 Spirit Bio TWIN)。

2 方法

2.1 动物造模、分组及给药

动物高脂肪饮食喂养3月后，饮水中加入氢醌至终浓度为0.8%，继续饲养3月完成造模。动物分组：年龄对照组(正常饮食)、溶媒对照组(高脂饮食+氢醌)、阳性药物组(高脂饮食+氢醌+乐盯)，补肾益气活血方组(高脂饮食+氢醌+中药)。补肾益气活血方分低、中、高3个剂量组，给药量分别为：5.4、10.8、21.6 g/kg。乐盯给药量0.1 g/kg。溶媒为蒸馏水。灌胃给药，每日1次，持续3月。

2.2 电镜观察

各组实验动物血清及视网膜组织SOD、GSH-Px、CAT活性检测结果见表2。由表2可见，血清SOD、GSH-Px、CAT活性明显高于视网膜组织；与年龄对照组比，溶媒对照组动物血清及视网膜组织上述3种酶活性显著降低(P<0.01)；与溶媒对照组比，阳性药物组对3种酶活性没有影响，补肾益气活血方高、中、低3个剂量组中，低剂量补肾益气活血方提高血清及视网膜组织GSH-Px、血清CAT酶活性(P<0.05)，中剂量补肾益气活血方能提高血清3种酶(P<0.05～0.01)及视网膜组织GSH-Px酶活性(P<0.01)，高剂量补肾益气活血方则能提高血清及视网膜组织3种酶活性(P<0.05～0.01)，且对SOD酶活性提高作用优于中、低剂量(P<0.05)。

2.3 小鼠血清和视网膜SOD、GSH-Px、CAT活性检测

各组实验动物电镜观察代表性图片见图1，RPE下沉积物评分及Bruch膜厚度见表1。与年龄对照组比，溶媒对照组RPE下沉积物显著增加，Bruch膜明显增厚(P<0.01)；与溶媒对照组比，阳性药物组模型小鼠RPE下沉积物减少(P<0.05)，但对Bruch膜厚度影响不明显，补肾益气活血方高、中、低3个剂量组均可使RPE下沉积物减少(P<0.05)，且中、高剂量的补肾益气活血方对Bruch膜厚度增厚有抑制作用(P<0.05)。

2.4 小鼠血清和视网膜ROS、MDA含量测定

血清及组织取材同上。血清ROS检测采用Fenton反应及griess试剂显色法测定，组织匀浆ROS检测采用DCFH-DA法，血清及组织匀浆MDA检测采用TBA比色法。上述检测均按试剂盒说明书操作。

2.5 qPCR实验

引物：Nrf2 F:5'-AGTGACTCGGAAATGGATGAG-3'，R:5'-TGTGCTGGCTGTGCGTTAGG-3';HO-1 F:5'-GCTGGTGATGGCTGCCTTGT-3',R:5'-ACTGGGTGCTGCTTGTTGCG-3';NQO-1 F:5'-ATGTATGACAATGGACCCTTCC-3';R:5'-TCCCTTGCAGAGTGTCCATGG-3';GCL F:5'-GAAGTGGATGTGGACACTAGATG-3';R:5'-TTGTAGTCAGGATGGTCTGCGATAA-3';GAPDH F:5'-ATGACATCAAGACGGTGGTG-3';R:5'-CATACCAGGTATGAGCTTG-3'。

观察期满处死动物，用Trizol等试剂提取视网膜和脉络膜总RNA，按照逆转录试剂盒操作步骤进行反转录。所得cDNA在实时荧光定量PCR仪上进行反应。每次扩增的同时设置cDNA的阴性对照。将PCR产物做熔解曲线，证实以上PCR反应产物特异性良好。统计△△Ct值以比较各组mRNA的表达。

在临床上可表现为典型进展、快速进展和长期缓慢进展三种转归。影响HIV感染临床转归的主要因素有病毒、宿主免疫和遗传背景等。需要注意的是，我国男男性行为感染HIV者病情进展较快，感染后多数在4～5年进展到艾滋病期[7]。

2.6 Western blot实验

采用SPSS 18.0统计软件，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，计量结果以表示。P<0.05为差异有统计学意义。

（一）孤僻淡漠。这是单亲家庭子女性格缺陷中表现最突出的一点，具体表现为性格内向、寡言少语，与人相处冷漠；缺乏热情，不愿参加集体活动，对身边事漠不关心；因家庭的变故而变得性格叛逆、标新立异、自我中心、自私；因有被抛弃的感觉而厌恶或憎恨父母，羡慕其他同龄人享受着的亲情，内心充满压抑，害怕同伴的耻笑，通常以自己不健康的心理来揣测别人，易把自己封闭起来，还有可能仇视社会，形成一种病态人格。

2.7 统计学方法

从视网膜和脉络膜组织提取蛋白(Nrf2另提取核蛋白)，BCA法测定蛋白浓度。变性后取50 μg上样，用10%分离胶、5%浓缩胶电泳，之后转到硝酸纤维素膜上。加一抗(1：1 000) 4 ℃孵育过夜后加兔二抗(1∶5 000)，GAPDH为内参(核蛋白内参为Lamin-B)，按0.1 mL/cm2加入化学发光试剂，采用凝胶成像分析系统检测各蛋白条带。

3 结果

3.1 电镜观察

观察期满，眼静脉取血分离血清，摘取眼球分离视网膜并匀浆，在3 000 r/min，4 ℃下离心10 min，上清用于检测。检测时取样100 μL，分别在550、412、405 nm波长下按照SOD、CAT和GSH-PX检测试剂盒说明书操作测定OD值，计算酶活性。

  

A.年龄对照组；B.溶媒对照组；C.阳性药物组；D.补肾益气活血方低剂量组；E.中剂量组；F.高剂量组

 

图1 各组实验动物电镜观察结果(×11 000)

3.2 SOD、GSH-Px、CAT活性

观察期满处死动物，摘取眼球，放入4%多聚甲醛中固定20 min。去除角膜、晶体及玻璃体，在视乳头两侧切取2×4 mm球壁，常规戊二醛、锇酸固定，环氧树脂包埋，超薄切片后，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察、摄片。RPE下沉积物半定量评定及Bruch膜厚度测量按照文献[3]方法进行。

氢醌(美国Alfa Aesar公司，CAS:615-67-8)，逆转录试剂盒(美国Thermo Scientific Fisher公司)(SuperScript Ⅲ,12574026)，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) (A001-1)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)(A007-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX) (A005)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)(S0131)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)(E004)试剂盒均自南京建成生物研究所，Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，兔Nrf2单克隆抗体(EP1808Y)、兔HO-1多克隆抗体(ab13243)、兔GCL单克隆抗体(EPR6668)、小鼠NQO-1单克隆抗体(A180)、小鼠-actin单克隆抗体(AC-15)、兔Lamin-B多克隆抗体(ab16048)、羊抗兔(ab6721)和兔抗小鼠(ab6728)IgG/HRP二抗均购自Abcam公司。

3.3 ROS、MDA含量

血清及视网膜组织ROS、MDA含量测定结果见表3。由表3可见，血清ROS、MDA含量明显高于视网膜组织；与年龄对照组比，溶媒对照组动物血清及视网膜组织ROS、MDA含量显著升高(P<0.01)；与溶媒对照组比，阳性药物、补肾益气活血方均可降低血清及视网膜组织ROS、MDA含量(P<0.05～0.01)，在高、中、低剂量补肾益气活血方3个观察组中，高剂量组作用优于中、低剂量组(P<0.05)。

 

表1 小鼠RPE下沉积物评分及Bruch膜厚度比较

  

组别RPE下沉积物评分Bruch膜厚度/μm年龄对照组1．86±0．450．35±0．06溶媒对照组4．29±1．03∗∗0．68±0．09∗∗阳性药物组3．24±0．47#0．59±0．08中药低剂量组3．18±0．44#0．56±0．07中药中剂量组3．06±0．39#0．48±0．07#中药高剂量组2．91±0．38#0．45±0．06#

注：与年龄对照组比较，**P<0.01，与溶媒对照组比较，P<0.05。

 

表2 小鼠血清及视网膜组织SOD、GSH-Px、CAT活性比较

  

组别血清/(U·mL-1)SODGSH PxCAT组织/(U·mg-1)SODGSH PxCAT年龄对照组55．08±4．80155．13±15．4210．38±0．7620．81±1．4410．32±0．693．47±0．15溶媒对照组27．03±1．57##71．35±9．14##3．52±0．39##8．27±0．89##3．06±0．31##1．18±0．06##阳性药物组31．36±2．5588．61±10．374．69±0．349．52±1．023．24±0．421．26±0．08中药低剂量组30．22±2．31122．43±12．08∗6．07±0．63∗10．14±1．236．65±0．35∗1．73±0．16中药中剂量组42．71±2．93∗134．26±10．48∗8．46±0．72∗∗11．58±1．479．37±0．57∗∗1．85±0．11中药高剂量组50．62±3．83∗△134．51±10．84∗9．25±0．75∗∗18．26±1．76∗△9．79±0．58∗∗2．02±0．16∗

注：与年龄对照组比较，##P<0.01；与溶媒对照组比较，*P<0.05,**P<0.01;与低剂量组比较，△P<0.05。

 

表3 小鼠血清及视网膜组织ROS、MDA含量比较

  

组别血清ROS(FI)MDA/(nmol·mL-1)组织ROS(FI)MDA/(nmol·mL-1)年龄对照组3187．3±134．513．4±2．5720．3±31．75．5±0．4溶媒对照组5537．6±176．2##39．6±5．1##1391．5±50．2##25．9±2．9##阳性药物组4673．8±157．6∗23．9±2．9∗989．5±41．3∗7．1±0．6∗∗中药低剂量组4847．2±178．3∗26．8±3．2∗1072．2±42．6∗8．4±1．01∗∗中药中剂量组4196．5±119．1∗20．6±2．1∗943．9±31．6∗7．6±0．5∗∗中药高剂量组3779．3±98．9∗∗△16．2±1．7∗∗△708．2±22．8∗∗5．4±0．7∗∗△

注：与年龄对照组比较，##P<0.05;与溶媒对照组比较，*P<0.05,**P<0.01;与低剂量组比较，△P<0.05。

3.4 qPCR各组实验动物Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA转录水平

结果见图2。与年龄对照组比，溶媒对照组动物Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL转录水平升高(P<0.05)；与溶媒对照组比，阳性药物、低剂量补肾益气活血方组Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL转录水平没有统计学差异，补肾益气活血方高剂量组转录水平则明显高于溶媒对照组(HO-1、NQO-1:P<0.01，Nrf2、GCL:P<0.05)，中剂量组HO-1、NQO-1转录水平升高。

3.5 Western blot法分析各组实验动物胞核、胞浆Nrf2表达水平

结果见图3。由图3可知，与年龄对照组比，溶媒对照组动物胞核Nrf2表达水平升高(P<0.05)，胞浆Nrf2表达水平无显著差异；与溶媒对照组比，阳性药物组胞核、胞浆Nrf2表达水平没有显著性差异，补肾益气活血方3个剂量组胞核Nrf2表达水平上调(P<0.01)，高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)，阳性药物及补肾益气活血方低剂量组胞浆Nrf2表达水平无明显差异，补肾益气活血方中、高剂量组表达上调(P<0.05)。

  

图2 各组动物Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL mRNA转录水平比较

 

  

注：与年龄对照组比较，##P<0.01;与溶媒对照组比较，※P<0.05，※※P<0.01；与低剂量组比较，△P<0.05。

 

图3 各组动物胞核、胞浆Nrf2蛋白表达比较

各组实验动物HO-1、NQO-1、GCL表达水平检测及分析结果见图4。由图4可知，与年龄对照组比，溶媒对照组动物HO-1、GCL表达水平上调(P<0.05)。表达水平差异不明显；与溶媒对照组比，阳性药物组HO-1、NQO-1、GCL表达水平没有显著性差异，补肾益气活血方高、中剂量组表达水平上调(P<0.05)，而低剂量组仅在NQO-1表达上调。

 

  

注：与年龄对照组比较，#P<0.05，与溶媒对照组比较，※P<0.05。

 

图4 各组动物HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达比较

4 讨论

大量研究表明，氧化损伤是AMD最为重要的发病机制，抗氧化损伤是AMD防治的有效途径。如AREDS (Age-Related Eye Disease Study，AREDS)在2001年开展的首个多中心随机前瞻性研究，评估了药理剂量的抗氧化剂，包括-胡萝卜素、维生素C和维生素E、锌和铜等对AMD进展及视敏度的影响，证实应用抗氧化剂可以在5年内使晚期AMD进展的风险降低25%，中度视力下降的风险降低19%[4]。乐盯的主要成分是叶黄素，具有很强的抗氧化作用，我们的研究发现枸杞提取物及其成分叶黄素和玉米黄素对氧化损伤模型小鼠视网膜及ARPE-19细胞有保护作用[5]。此外，乐盯中的维生素C、维生素E和锌离子也有抗氧化作用。

事故当时，系统最高电压等级为220kV，主系统仍然以110kV为主，系统与那曲地区电网间只有一条110kV 联络线即当那线（110kV当雄变—110kV那曲变），那曲地区电网主要由一座110kV那曲变、安多变、35kV查龙水电厂及部分35kV变形成，由于那曲地区电网仅有一座查龙水电厂（4台机组，4×2.7兆瓦），所以那曲地区电网供电主要依靠系统通过唯一一条 110kV当那线输送，尤其事故当时处冬季枯水期，因水库来水问题，查龙水电厂只能保证单台机运行（事故当时#3机组）运行，110kV那曲变那曲变两台主变（#1、#2）其中规定正常方式安排#1主变中性点接地运行。

《美国国立卫生研究院资助政策声明》对项目管理中的流程和要求均做了具体规定，在网站上提供申请流程指南、会议评审的录像示范和解说、项目评审反馈意见、立项过程管理、绩效报告填报等方面的全面、详细、生动的政策介绍和解答，使得项目管理人员、申请者和（或）受资助者、承担单位等均有法可依、有章可循。

中医认为本病属视瞻昏渺，发病与肝、脾、肾的功能失调有关。目为肝之窍，肝受血而能视，五脏六腑之精气皆上濡于目；肾为先天之本，肾藏精，受五脏六腑之精而藏之，肾精充足，方能目视精明。肝肾阴精不足、脾气亏虚则目失所养，视物不清。肝肾阴虚，虚火上炎，炼液为瘀；脾气虚，推动无力，血行迟涩而为瘀；津血不足，脉络空虚，血行停滞亦可致瘀。瘀血留滞于脉络，导致脉络瘀滞，使精血不能上行于目，目失所养而视物不明。因此，AMD为本虚标实之证，脾气虚弱、肝肾精血不足是本，痰湿、血瘀是标，前者始终贯穿于疾病的全过程。基于AMD的病机，不少医家采用滋补肝肾、益气健脾、活血化瘀法治疗干性AMD，如陆萍等用柔肝健脾、滋阴明目法治疗肝肾亏损、气血亏虚型干性AMD[6]，关红丹用滋补肝肾、健脾祛湿法治疗AMD[7]，均取得一定效果。临床上，我们以滋补肝肾、益气健脾经验方治疗干性AMD，发现能减缓早、中期干性AMD的进展，疗效优于乐盯。

当互助会走向解散这两天里，他正在编辑第十五期，他听到要停刊时，非常气愤。他说：这次的剧情，我还不知道，正在为他们编辑第十五期《曲江工潮》，而梅坤来和我说及这剧本的过去！呵！一个团体的内部如此，我能挽回么，梅坤能挽回么？

本研究采用的是优化后的组方。其中枸杞子、桑椹子滋阴明目；菟丝子、山萸肉为平补阴阳要药，用其有阳中求阴之意；田七、川芎、生山楂具有祛瘀生新、活血明目功能；葛根理气活血；太子参、黄芪、白术、茯苓益气健脾；槐花有清热作用，其主要成分槲皮素有很强抗氧化作用，能显著减轻H2O2诱导的ARPE-19细胞氧化损伤[8]。本研究观察到，乐盯及补肾益气活血方高、中、低3个剂量均可使RPE下沉积物减少，中、高剂量的补肾益气活血方对Bruch膜厚度增厚有抑制作用，显示乐盯及补肾益气活血方对干性AMD模型动物视网膜有保护作用，中、高剂量的补肾益气活血方优于乐盯；乐盯对SOD、GSH-Px、CAT3种重要的抗氧化酶活性没有影响，高剂量补肾益气活血方则能提高动物血清及视网膜组织3种酶的活性，对SOD酶活性提高作用优于中、低剂量；乐盯、补肾益气活血方均可降低动物血清及视网膜组织ROS、MDA含量，补肾益气活血方高剂量作用优于中、低剂量。这些研究结果提示，乐盯对模型动物视网膜的保护作用可能与其成分中的抗氧化剂直接中和活性氧有关，而补肾益气活血方的作用与提高抗氧化酶的活性有关。研究表明，Nrf2通路与AMD发病关系密切。为此，本研究观察了乐盯、补肾益气活血方对Nrf2通路及其下游靶基因酶HO-1、NQO-1、GCL表达水平的影响，发现乐盯对Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL转录水平没有影响，补肾益气活血方中、高剂量组则转录水平明显升高；乐盯对胞核、胞浆Nrf2蛋白表达水平没有影响，补肾益气活血方能显著上调胞核Nrf2蛋白表达水平，对胞浆Nrf2蛋白表达水平也有一定影响；乐盯对HO-1、NQO-1、GCL表达水平没有影响，而补肾益气活血方高、中剂量可显著上调HO-1、NQO-1、GCL表达水平。这些结果提示，补肾益气活血方可能通过激活Nrf2通路，提高SOD、GSH-Px、CAT酶活性，上调下游靶基因酶HO-1、NQO-1、GCL表达水平，从而增强对活性氧的清除作用，对氧化损伤模型小鼠视网膜起到保护作用。

总之，优化后的补肾益气活血方可能通过激活Nrf2通路，提高SOD、GSH-Px、CAT酶活性，上调下游靶基因酶HO-1、NQO-1、GCL表达水平，增强对模型动物体内活性氧的清除，对视网膜氧化损伤起到保护作用。本研究通过干性AMD模型动物证实了补肾益气活血方的有效性，并初步探明了作用机制，为下一步开展临床研究提供了依据。

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[3] 黄冰林,杭丽,郑仕中,等.枸杞提取物对高脂饮食及氢醌诱发的小鼠视网膜色素上皮下沉积物形成的抑制作用[J].南京中医药大学学报,2013,29(1):29-34.

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