糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病引起的危害性最大的慢性微血管并发症，早期表现为尿中微量蛋白,继而出现持续蛋白尿、水肿、高血压、肾功能不全,最终发展至终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)，预计在未来的20年内DN将成为终末期肾衰竭最重要的原因。当归补血汤出自金元时代李东垣的《内外伤辨惑论》，是由黄芪和当归2味药以5∶1组成的经典的益气补血活血方剂，已传承了数千年。随着现代医学科学技术的渗入,发现当归补血汤及其组成药物具有促进造血、调节免疫功能、保护心脑血管、保护肝脏、抗肿瘤、抗炎、降糖等多种药理作用[1-2]。肾性糖尿病患者的糖代谢异常会导致肾小球硬化并伴尿蛋白含量超标，引起DN。Ke[3]发现当归补血汤可以抑制糖尿病引起的肾小球系膜细胞增殖、减少胶原Ⅳ、层粘蛋白、纤维蛋白，特别是高浓度当归补血汤对早期DN有明显的治疗价值。任小旦等[4]进一步证实当归补血汤能抑制高糖引起的系膜细胞增殖、α-SMA的过度表达、HYP分泌,从而预防肾小球硬化和肾小管间质纤维化的发生,进而延缓DN的进程。

方剂的可重复性疗效、质量控制与用药安全的三大问题，已引起国际上广泛关注。导致上述三大难题的关键原因是代表方剂疗效的体内药效物质及其作用原理不明确。因此寻找适于中药复杂体系的研究方法,阐明中药效应物质基础及作用的本质,一直是中药研究的首要科学问题[5]。中药口服后药效的物质基础是吸收入血的生物活性成分(Absorbed bioactive compounds,ABCs)。以此为切入点,黄熙教授在大量实验基础上,提出了生物方剂分析(Bioethnopharmaceutical analytical pharmacology,BAP)药理研究策略[6]。基于此策略，我们对当归补血汤中主要体内吸收成分进行了定性定量，在2型糖尿病模型GK大鼠上观察ABCs的肾保护作用，并与母方进行比较，探讨当归补血汤降低血糖、改善DN大鼠肾功能的物质基础及作用机制。

通过对以上国内外研究的调查发现，现在Milkrun系统的研究应用主要集中在入场物流上，而对于其他方面的研究应用比较少。本文在Milk-run现有模式的基础上，将其应用到厂内车间物流配送上，讨论其运行模式及实施方法，找出一条适用于装配线车间的新配送模式，从而优化生产物流。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

GK大鼠30只，Wistar大鼠10只，雄性，体质量150～200 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)-2012-0002。动物适应环境1周,室温(22±2)℃,湿度(60±4)%，按照昼夜各12 h循环。

药材黄芪2 000 g,当归500 g购自北京同仁堂大药房。阿魏酸(批号：110773-201614)、黄芪甲苷(批号：110781-201515)标准品由中检院提供，芒柄花素(批号：14091205)、毛蕊异黄酮(批号：14070923)、咖啡酸(批号：1509083)、藁本内酯(批号：16060801)、丁苯酞(批号：15070429)、槲皮素(批号：16070513)由成都曼斯特生物科技有限公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：20160616)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号：20160610)由南京建成生物工程研究所提供，BCA蛋白测定试剂盒(批号：P0012)由碧云天生物公司提供；4%多聚甲醛(Biosharp)；戊巴比妥钠(Merck)。

1.2 当归补血汤制备

根据处方依次等量称取黄芪100 g、当归20 g,置于圆底烧瓶中,加8倍(g/mL)纯水室温浸泡60 min,电热套加热至沸腾开始计时，煎煮30 min,8层纱布过滤,滤渣再加6倍(g/mL)纯水,搅拌后继续煎煮30 min,过滤,合并2次滤液,置于旋转蒸发仪中,60 ℃下旋转蒸发浓缩,得当归补血汤浓缩液100 mL(浓度为1.2 g/mL)，冷冻干燥，备用。

1.3 当归补血汤体内活性成分定性定量分析

采用SPSS15.0软件统计包，计量资料据用表示，采用方差分析完成各组，均值间的配对比较，P<0.05为差异有统计学意义。

 

表1 UPLC-MS/MS检测条件

  

离子模式DP/VEP/VCE/VCXP/VTime/msm/z阿魏酸ESI--85-10-20-1350193．0>134．0黄芪甲苷ESI--50-10-30-3350783．2>283．0芒柄花素ESI--215-10-28-2150267．0>252．0毛蕊异黄酮ESI--180-10-26-1150282．9>268．0咖啡酸ESI--80-10-20-1150179．0>135．0藁本内酯ESI+8110331250191．1>91．0丁苯酞ESI+7610191650190．7>145．1槲皮素(内标)ESI--54-10-30-1650301．1>151．0

1.5.2 尿蛋白检测 代谢笼收集24 h尿液，记录24 h尿量，尿液经3 000 r/min，离心10 min，取上清，-20 ℃保存。采用全自动生化分析仪检测24 h尿总蛋白和尿白蛋白。

模型组动物活动较少，体质量增长较空白对照组大鼠明显缓慢，与模型组相比，2组给药动物体质量未见明显增长。与模型组相比，给药28 d后，当归补血汤、ABCs组动物空腹血糖均显著降低(P<0.01)。肾脏系数结果显示，当归补血汤及ABCs均能够改善糖尿病大鼠的肾脏肥大，与模型组相比，当归补血汤组差异显著(P<0.05)。见图1。

对于格林函数的建立，我们采用了具有地球变平近似的一维速度模型。由于各个地方的区域模型多数不能用，我们对神户和所罗门群岛地震、东北余震和玻利维亚地震采用了Iasp91模型（Kennett and Engdahl，1991）。在我们这组地震中，伊兹米特地震是唯一的例外，可用由Bulut等（2007）对其导出的区域模型（图2）。

1.4 动物分组与给药

GK大鼠30只，按血糖随机分为模型组、当归补血汤组(4 g/kg)、ABCs组(剂量相当于母方含量，即咖啡酸5.36 mg/kg，芒柄花素2.68 mg/kg，毛蕊异黄酮2.56 mg/kg，阿魏酸1.36 mg/kg，黄芪甲苷0.45 mg/kg，丁苯酞0.16 mg/kg，蒿本内酯0.16 mg/kg)，每组10只，同时10只Wistar大鼠做空白对照，每天灌胃等量的生理盐水，每日1次，连续给药28 d，观察ABCs对GK大鼠肾脏的保护作用。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 动物一般状态观察及体质量、肾脏系数 观察动物的一般状况：如精神状态、反应、行为活动、排便情况、眼睛及孔道分泌物、毛色及清洁度等。1周1次固定时间监测体质量。动物处死前禁食12 h测定空腹血糖。

确定ABCs由下述7种成分组成，按含量均值大小依次为：阿魏酸>咖啡酸>藁本内酯>毛蕊异黄酮>芒柄花素>丁苯酞>黄芪甲苷。为确定动物实验给药剂量，进而定量1 g方剂中上述成分浓度(mg/g)为：咖啡酸1.34、芒柄花素0.67、毛蕊异黄酮0.64、阿魏酸0.34、丁苯酞0.04、蒿本内酯0.04，内标为槲皮素(200 ng/mL)。由于黄芪甲苷响应较低，且干扰大，未能精确定量，剂量参考他人研究结果[7]。我们拟对上述7种ABCs进行后续动物实验。

（3）凌文辁、张治灿与方俐洛通过对5000名员工的7轮预测和2000名员工的正式测验，编制出了由情感承诺、理想承诺、规范承诺、机会承诺和经济承诺五因素构成的“中国职工组织承诺量表”。该量表的总方差解释量达66.11%，相关分析也表明，各因素与效标的相关均达到非常显著水平，各因素的信度在0.7-0.89之间，量表的信度和效度良好。因为此份量表是在中国文化背景下编制的，因而对国内的研究有很大的指导意义。

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1.5.4 病理切片 处死后取双肾,去除包膜,用预冷的生理盐水洗净,滤纸拭干,称质量，计算脏器系数。脏器系数(%)=脏器质量/动物体质量×100%。另分离肾皮质，4%多聚甲醛固定，常规HE染色，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4 μm厚)，HE染色，光学显微镜下阅片，观察其组织病理学改变情况。

1.6 统计学方法

10只Wistar大鼠，灌胃4 g/kg当归补血汤(按临床剂量换算)，30 min后,眼眶取血，分离血浆。UPLC-MS/MS(Q-TRAP5500-QQQ)定性定量检测，色谱柱：BEH-C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，柱温：40 ℃，进样体积：5 μL。流动相A(水):B(乙腈)梯度洗脱程序为:0～2 min,75%～75%A;2～3 min,75%～60%A;3～5 min,60%～10%A;5～8 min,10%～0%A。流速：0.3 mL/min，质谱检测条件见表1。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量、血糖及肾脏器系数

在技术更新的新形势下，数字地形测图逐渐取代了传统的地形测图，在城市测量中发挥着重要的作用。通过对数字地形测图的分析，明确其是在传统的地形测图的基础上，利用先进的全球定位系统等技术，实现对地形测图技术的更新。从某种角度而言，将数字地形测图应用到城市测量中，能够使城市各区域的地形地貌有效地展现出来，为日后城市的科学规划，奠定坚实的基础。为此，本文在研究中通过对数字地形测图的综合分析，重点阐述了其在城市测量中的应用。

1.5.3 肾组织氧化应激指标测定 肾组织以10倍体积的生理盐水匀浆，离心(3 200×g，20 min，4 ℃)取上清检测MDA、SOD。操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.2 各组小鼠尿蛋白结果比较

当归补血汤组、ABCs组显著降低糖尿病模型大鼠尿总蛋白和尿白蛋白，当归补血汤组差异更为显著(P<0.01)，结果见图1。

 

 

 

 

 

  

注：与空白组相比,#P<0.05,##P<0.01; 与模型组相比,*P<0.05，**P<0.01。图1 当归补血汤及ABCs对GK大鼠空腹血糖、肾系数、尿总蛋白、尿白蛋白及氧化应激指标的影响

2.3 各组小鼠肾氧化应激指标比较

糖尿病模型组大鼠肾脏总SOD活力较正常组大鼠显著下降，而肾组织MDA含量明显升高，当归补血汤组大鼠肾脏总SOD活力较模型组明显升高(P<0.05)，而ABCs组MDA水平较模型组明显下降(P<0.05)，接近正常水平，结果见图1。

2.4 病理结果

HE染色显示正常组大鼠肾小球、肾小管、肾间质形态结构正常，模型组有较多肾间质炎性细胞浸润，当归补血汤组肾小管上皮空泡变性现象明显改善，已接近正常，ABCs组也明显改善，但仍偶见肾小管上皮空泡变性现象。见图2。

  

空白对照组

  

模型组

  

当归补血汤组

  

ABCs组图2 肾脏病理切片(HE,×200)

3 讨论

鉴于糖尿病患者肾组织中的糖代谢紊乱并有氧化应激存在,肾组织中抗氧化酶发生了氧化或糖化的现象,导致肾皮质中抗氧化酶,如SOD含量明显降低,导致肾组织抗氧化能力显著降低[8]。我们研究发现糖尿病模型组大鼠肾脏总SOD活力较正常组大鼠显著下降，而肾组织MDA含量明显升高，均说明糖尿病大鼠肾组织抗氧化能力处于低下状态,证实氧化应激可能在DN的发生和发展中起着一定的作用。当归补血汤及ABCs显著降低糖尿病大鼠尿总蛋白、尿白蛋白和肾脏MDA水平(P<0.05)，显著升高肾脏总SOD活力(P<0.05)，作用机制主要与降血糖、降低尿蛋白、改善肾脏抗氧化等作用密切有关。

董晴[9]对当归的化学成分进行详细的报道,指出挥发油中藁本内酯是其主要成分,还含有少量香荆芥酚、苯酚、对甲苯酚等化合物。阿魏酸为当归中的主要有机酸，并且含有至少16种氨基酸,其中精氨酸的含量最大(1.72%),谷氨酸次之(0.72%),还有赖氨酸、缬氨酸、色氨酸等8种为人体所必需但又不能自行合成的氨基酸。黄芪主要含皂苷类、黄酮类、多糖类、氨基酸类、微量元素、甾醇类、叶酸、亚麻酸、甜菜碱、胆碱、咖啡酸、维生素P、淀粉E等。目前从黄芪及其同属近缘植物中已分离出40多种皂苷,黄芪属植物中分得黄酮或黄酮类物质30多种,主要有槲皮素、山奈黄素、异鼠李素、羟基异黄酮、芒柄花素、毛蕊异黄酮等[10]。黄芪的多糖成分主要有葡聚糖和杂多糖,由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等组成。当归补血汤成分复杂，我们的研究目前聚焦于大鼠吸收入血成分，也是文献报道较多的7种主要活性成分，按体内含量大小依次为阿魏酸、咖啡酸、藁本内酯、毛蕊异黄酮、芒柄花素、丁苯酞、黄芪甲苷。药物体内含量远小于生药含量，为与母方保持一致性，我们采用体外含量作为ABCs组给药依据进行药效研究，结果发现当归补血汤组作用较ABCs组更为显著。我们认为ABCs能够代表母方当归补血汤发挥对GK大鼠的肾保护作用，但作用不及母方显著。说明母方中含有的微量元素、氨基酸、多糖等其他成分也同时发挥着重要的药效作用，其具体原因还有待进一步证实。目前当归补血汤其他入血成分的检测及改善DN、神经病变的深入药效机制正在研究中，以期为该方体内药效物质基础的阐明打下坚实的基础。

参考文献:

[1] 仝小林.糖尿病中医防治指南解读[M].北京：中国中医出版社，2009.

[2] 曾宇，张三印，胡冠英.当归补血汤的研究进展[J].时珍国医国药，2016，27(2)：422-424.

[3] KE HL，ZHANG YW，ZHOU BF，et al． Effects of Danggui Buxue Tang，a traditional Chinese herbal decoction，on high glucose-induced prolif-eration and expression of extracellular matrix proteins in glomerular me-sangial cells[J]．Nat Prod Res，2012，26(11) : 1022-1026.

[4] 任小旦，王秀萍，郑保根,等.当归补血汤对高糖条件下系膜细胞增殖、α-SMA表达及HYP的影响,中华中医药学刊，2016,34(3)：635-638.

[5] YUAN R, LIN Y. Traditional Chinese medicine: an approach to scientific proof and clinical validation [J]. Pharmacol Therapeut,2000,86(2), 191-198.

[6] 黄熙，范荣，张海南,等.生物方剂分析药理:阐明方剂吸收生物活性成分的研究策略[J].中草药,2010,41(3)：337-339.

[7] 潘自皓，崔梦迪，潘立群,等.当归补血汤中三种指标性成分的HPLC-DAD-ELSD法同时测定[J].时珍国医国药，2016，27(3)：547-550.

[8] 余凌，李惊子，王海燕.黄芪、当归在肾脏疾病中的应用及其机制研究进展[J].中国中西医结合杂志，2001，21(5)：396-398.

[9] 董晴，陈明仓.当归化学成分及药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2016，12(2)：32-34.

[10] 刘德丽，包华音， 刘杨.近5年黄芪化学成分及药理作用研究进展[J]. 食品与药品，2014,16(1):68-70.