中医理论与实践中，针对相同的疾病不同的证候给予区分化的治疗，是其优势的体现。廓清疾病与证候的关系已成为现代中医学与中西医结合的关键问题，而揭示病证内在联系科学内涵需要有合适的动物模型。在病证研究中，目前较多采用疾病造模叠加证候造模的方法[1]，但是容易造成模型不稳定与不易重复问题，且难以体现病证的内在联系。也有部分病证研究，只进行疾病造模，然后评价证候表现[2]，其优点是容易重复，也可以进一步研究病证的内在关联。

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官,但主要侵犯肺脏,称为肺结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。潜伏期4~8周[1]。其中80%发生在肺部,其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。

图5中(a)、(c)、(e)为改进型ADRC对交流伺服电机的控制曲线；(b)、(d)、(f)为传统ADRC对交流伺服电机的控制曲线。

抑郁症是影响人类身心健康的主要疾患，以女性居多，现代医学对其的治疗效果尚不令人满意，一个重要的原因是对抑郁症这个异质性疾病没有实施区分化治疗[3]。抑郁症病人表现为多种证候，而气虚是抑郁症中最常见的证候类型之一[4-5]。我们前期实验研究发现，用慢性不可预知轻度应激(CUMS)方法或其他的方法进行抑郁症造模后，Balb/c小鼠都表现为气虚样抑郁，而129/S1小鼠都没有气虚样表现，支持遗传差异是证候差异的重要来源[6]。由于对证方剂的疗效依据是确认中医证候的重要条件[7]，为确认单独抑郁症疾病造模条件下Balb/c的气虚证候特点，本研究选用补气代表方四君子汤，观察其治疗效果来反证该证候。此外，外周与中枢中的PKA-CREB信号与气虚证候及抑郁症都有密切关系[8]，本研究还检验了四君子汤对模型小鼠的海马与肌肉组织中PKA-CREB通路表达的影响，为确立证候与病证相关性提供微观证据。

1 材料

1.1 实验动物

健康雌性Balb/c小鼠34只，体质量18～22 g，由南京市青龙山动物繁殖场提供，许可证号：SCXK(苏)2017-0001。动物饲养于南京中医药大学转化系统生物学与神经科学研究中心SPF级动物屏障房内，室温21～25 ℃，相对湿度为50%～60%。

电气工程控制领域引入智能控制系统，可以提高电气工程的自动化控制程度，及时在没有工作人员值守的情况下电气工程也可以自动化的运行和操作，实现电气工程运行的高效化。电气工程控制包含内容众多，智能控制系统可以在计算机虚拟世界中对电气工程运行环境进行模拟，同时具备了参数自动化桃姐以及刀具补偿功能，可以将加工过程可视化的呈现出来，进一步加强了工作人员对电气工程运行状态的了解。

1.2 药物与试剂

实验用四君子汤由人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g组成。经南京中医药大学刘圣金副教授鉴定，为《中国药典》收载品种。上述药物加8倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h过滤，再加6倍量水按上法煎煮后过滤，合并2次药液,65 ℃减压旋蒸浓缩，浓缩后的药物终浓度为0.5 g/mL。配好的药物分装在10 mL离心管内，-20 ℃保存。兔抗CREB(Cell Signaling Technology，1∶1 000)；兔抗p-CREB(Cell Signaling Technology,1∶500)；兔抗PKA(Cell Signaling Technology，1∶1 000)；兔抗-tubulin(北京中山金桥，1∶2 000)。

加大政府宣传力度，电视、新闻、报纸、网络等媒体深入宣传国家粮食政策，报道耐密型玉米增产典型、高产栽培技术和增产潜力。良种补贴向耐密型玉米品种倾斜，适当增加玉米高产创建示范区数量，做好示范观摩，让更多农民亲身体验耐密型玉米的增产实效，从而积极主动地选择耐密型玉米品种，改变种植稀植大穗的老习惯。

1.3 仪器

悬尾/强迫游泳行为分析系统(Anymaze)；HANDPI数显推/拉力计(HP-100浙江乐清艾德堡仪器有限公司)；旋转蒸发仪(河南巩义予华仪器设备有限公司)；摄像机(Panasonic)；蔗糖(国药集团化学试剂有限公司)；1 mL注射器(BD公司)，体视显微镜(苏州银瑞计量仪器有限公司)；Nanodrop 2000(Thermo)；蛋白电泳及转膜系统(Bio-Rad)；凝胶成像及分析系统(Tannon)。

2 方法

2.1 动物分组及CUMS模型的制备

2.2.7 抓力 测量各组动物的抓力，记录每次每只小鼠的最高抓力，重复测量5次，以其平均最高抓力作为最终值。以此评测小鼠自然反应条件下的抓力评测值[10]。

2.2 小鼠的行为学测试

2.2.9 皮毛评分 将小鼠按照头颈部、躯干背部、腹部、四肢划分4个部位，每个部位观测其污秽，掉毛及穗结情况，以0及1分值记录，最高分值12分。

现在来杀秀容川的，已是绝顶高手了。他们都不是秀容川的对手。最近来的一个刺客，和秀容川不打不成交，反成了朋友。刺客是画家，他对秀容川说：“我听说了，将有一个最厉害的人来杀你，这个人，就是你我联手都不是他对手。明早你来我家，我告诉你他是谁。”

造模4周后，与空白组相比，模型组小鼠体质量显著下降(P<0.01)。糖水测试显示，与空白组相比，模型组蔗糖消耗百分比显著下降(P<0.01)。见图1。

2.2.2 开场测试 测试当天将小鼠放到实验室，先让其适应环境30 min。然后将实验动物从黑色观察箱的底部中央以头部朝前的位置放入，关上箱门，在安静环境下用DigBehv动物行为分析系统连续采集5 min。采用DigBehv动物行分析系统采集、存储和分析视频信号。将每个场划分为中央区域和周边区域。以活动总路程、评价小鼠自发活动的特点，中央区域停留时间评价焦虑样行为。

2.2.3 悬尾测试 将实验动物的尾部1～3 cm处以医用微孔胶布黏贴在Anymaze动物行为分析系统配备的挂钩上，小鼠头下尾上距离箱底30 cm高处倒悬放入行为分析箱内，持续悬挂6 min，观察记录后4 min小鼠悬挂后停止挣扎的时间(不动时间)。

工程场地位于浊漳河南源的漳河大桥上游，工程涉及范围为浊漳河及浊漳河两岸的未利用区域。主要内容为湿地设计、河道壅水建筑物设计及堤防加固等。

2.2.4 强迫游泳测试 将小鼠放入高30 cm、直径18 cm的圆柱形玻璃缸中，缸中水深10 cm，水温(25±1) ℃，小鼠在缸中游泳6 min,用Anymaze动物行为分析系统观察记录后4 min小鼠的漂浮时间(在水中停止挣扎和攀爬逃避活动，处于躯体漂浮水面状态的时间)。

造模4周后，与空白组相比，模型组小鼠抓力显著降低(P<0.05)，掌纹脉络血色度显著下降(P<0.05)，负重游泳时间显著下降(P<0.01)。见图2。

2.2.6 掌纹脉络血色度测试 根据方肇勤的方法，在25 ℃室温100 lux照度下以体视显微镜放大20倍采集模型小鼠前爪脉络图片，利用Photoshop CS5软件分析前爪第二、三掌趾肉垫间脉络，以R值除以RGB和值作为评价指标[9]。

将小鼠随机分为空白组与模型组，空白组(n=10)不予任何刺激，模型组每日随机给予1种刺激[湿笼16 h(将小鼠置于垫料潮湿的鼠笼)、禁水24 h、禁食24 h、空笼、斜笼、100 r/min摇床40 min，束缚6 h(将小鼠束缚于自制束缚筒中6 h，小鼠在其中活动受限)]+每周2次彻夜光照(100 W光照持续12 h)。连续造模4周。以模型组和空白组的糖偏好出现显著性差异判断模型组的抑郁表型是否出现。空白组和模型组小鼠均无死亡。4周后将模型组随机分为2组:模型对照组(n=12)，四君子汤组(n=12)。模型对照组予生理盐水以每10 g体质量灌胃0.1 mL，四君子汤组予四君子汤浓度0.5 g/mL,以每10 g体质量灌胃0.1 mL(相当于每1 g小鼠给予四君子汤生药0.005 g)。给药1周。

2.2.8 负重游泳 按小鼠体质量的10%～15%施以负重，将回形针固定在小鼠尾部1～3 cm处。将动物放入装有约3 L水的透明玻璃烧杯水，水深约15 cm，水温保持在(25±1)℃。观察并记录从小鼠被放入水中到力竭沉入水底超过8 s的时间[11]。

给药1周后进行开场测试、糖偏好测试、悬尾测试、强迫游泳测试、负重游泳测试、新奇环境摄食、掌纹脉络血色度测试、皮毛评分、抓力测试等。

2.3 Western blot法测定PKA-CREB蛋白表达

小鼠行为学测试结束后，立即进行冰上取脑，分离出海马组织。将海马组织称质量后，组织置于裂解液中匀浆10 min(质量体积比为1∶10)，匀浆后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，每管20 μL分装，-80 ℃保存。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，取3 μL样品/泳道上样，分离胶浓度为10%。电泳结束后，湿转法将蛋白转至PVDF膜上(4 ℃ 300 mA电转60 min)，转膜结束后,1%BSA室温封闭膜1 h，分别用兔抗CREB(1∶1 000)，兔抗p-CREB(1∶500)，兔抗PKA(1∶1 000)兔抗-tubulin(1∶2 000)一抗4 ℃孵育过夜。次日TBST漂洗10 min×3次后，二抗(1∶2 000)室温孵育1 h后加入ECL发光底物显色。Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统显影分析。用目的蛋白与各自-tubulin蛋白灰度比值表示其蛋白量。实验重复3次。

2.4 证候评判指标

气虚：抓力下降或负重游泳时间缩短[10-11]。

吸引读者注意:在网络信息的海洋中，“标题党”不惜用煽情、惊悚、污秽和侮辱性的词句赚取眼球。这种行为无疑是不可取的，但其出现和盛行也恰恰反映了新闻标题具有吸引读者注意的重要作用，影响了读者的阅读选择。因此各家媒体为了提高自己的行业竞争力，大多新闻标题会选用新词、热词，新的句法，新的观点和修辞的选用来恰当的提升新闻标题的趣味性。

2.5 统计学方法

测量结果以表示，采用Graphpad统计软件对2组间数据进行t检验，多组间数据进行单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

本文采用问卷调查的方法，以现场发放和网络发放两种形式对铜陵学院大学生进行调研，问卷共发出500份，收回的有效问卷有454份，该数据样本满足研究需求。

3 结果

3.1 Balb/c小鼠在CUMS下的抑郁样行为观察

2.2.1 糖水偏好测试 造模前以2%糖水连续适应3 d。测试前禁水24 h,双瓶测试2 h，检测指标为糖水消耗量/水总消耗量，作为评估“失乐”样抑郁状态的重要指标。

  

注：与空白组相比，**P<0.01。

 

图1 造模4周后小鼠的体质量和糖偏好

3.2 Balb/c小鼠在CUMS下的气虚表型观察

2.2.5 新奇环境摄食 将小鼠禁食16～18 h，放入一个新的鼠笼内，笼中央放置一食物(已称质量)，在安静环境下使用动物行为采集监控系统观察并记录10 min，以潜伏时间和摄食量为观测指标。潜伏时间是从放入笼内至小鼠开始咀嚼食物的时间，若5 min内没有吃食则默认潜伏时间是5 min。单位时间摄食量计算公式为:单位时间摄食量=5 min内消耗粮食质量/小鼠体质量。

  

注：与空白组相比，*P<0.05,**P<0.01。

 

图2 造模4周后小鼠的抓力(A)、爪色(B)和负重游泳时间(C)

3.3 四君子汤可改善模型小鼠的抑郁样行为和证候表型

给药1周后，在开场测试中，空白组、模型对照组和四君子汤组的总路程和中央时间无明显变化。如表1所示，与空白组相比，模型对照组体质量和蔗糖消耗百分比均显著下降(P<0.01)，而四君子汤可显著增加模型小鼠的体质量(P<0.05)和蔗糖消耗百分比(P<0.01)。模型对照组在小鼠强迫游泳和悬尾上不动时间均高于空白组(P<0.05～0.01)，四君子汤可明显降低模型小鼠的不动时间(P<0.01)。在新奇环境摄食中，模型对照组的潜伏时间显著高于空白组(P<0.05)，但四君子汤组的潜伏时间显著下降(P<0.05)。3个组的平均体质量摄食量没有显著差异(P>0.05)。

模型对照组的抓力、爪色和负重游泳时间均显著低于空白组(P<0.05～0.01)，四君子汤可显著增加模型小鼠的抓力(P<0.05)、爪色(P<0.05)和负重游泳时间(P<0.01)。皮毛评分显示，四君子汤组明显低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

 

表1 Balb/c小鼠的抑郁样行为

  

组别n体质量/g糖偏好/%强迫游泳/s悬尾/s新奇环境摄食潜伏时间/s单位时间摄食量/g空白组1024．080±0．57863．465±4．89675．000±6．06669．300±3．74165．000±18．6550．014±0．003模型对照组1220．551±0．723∗∗43．535±2．388∗∗94．200±3．825∗∗90．857±4．636∗107．000±34．359∗0．0128±0．002四君子汤组1221．296±0．661#61．973±2．108##71．038±4．634##72．075±16．468##75．222±37．215##0．013±0．006

注：与空白组相比，*P<0.05,**P<0.01;与模型对照组相比，#P<0.05,##P<0.01。

 

表2 Balb/c小鼠的证候表型

  

组别n抓力/N爪色皮毛评分负重游泳/s空白组101．989±0．1850．430±0．0100232．963±25．147模型对照组121．753±0．086∗0．407±0．005∗∗3．667±0．500∗∗151．750±40．732∗四君子汤组122．014±0．233#0．421±0．015#2．375±0．518##229．950±73．586##

注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01;与模型对照组比较，#P<0.05,##P<0.01。

3.4 四君子汤可逆转模型小鼠海马和肌肉组织中下调的PKA-CREB信号通路表达

如图3所示，在Balb/c小鼠的肌肉中，与空白组相比，模型对照组的PKA和p-CREB蛋白表达均明显下调(P<0.01)，四君子汤可使模型小鼠的PKA和p-CREB蛋白表达明显上调(P<0.01)。同样，在海马中，模型对照组的PKA和p-CREB蛋白表达明显低于空白组(P<0.01)，给予四君子汤后可明显上调模型小鼠的PKA和p-CREB蛋白表达(P<0.01)。

 

  

注：与空白组比较，**P<0.01;与模型对照组比较，##P<0.01。

 

图3 小鼠肌肉中的PKA(A)、p-CREB(B)蛋白表达变化以及海马中的PKA(C)、p-CREB(D)蛋白表达变化

4 讨论

合适的病证模型是理解和运用中医辨证论治区分化治疗疾病科学内涵的基础。证候的差异性受遗传与环境所影响[12]，例如，采用相同造模方法，不同遗传品系的小鼠证候表现不同[13]。我们近期研究结果也显示，遗传品系对证候差异具有显著而稳定的作用，证候的出现也存在易感性差别。在不同抑郁症疾病模型下，Balb/c小鼠都表现出气虚证候[6]。在此基础上,本研究进一步采用方药反证结合分子生物学方法，以确证该病证模型。观察到补气经典方药四君子汤可以明显改善模型动物表现出抓力下降、负重游泳时间减少、皮毛评分增加的气虚样表型，也改善了糖偏好下降等抑郁样行为。另外，四君子汤可逆转脑和肌肉PKA-CREB信号的下调。结果支持Balb/c小鼠在CUMS下的气虚抑郁病证类型。

本研究采用了公认的抑郁症疾病模型，CUMS模型[14-16]，和普遍使用的气虚样证候[9-10]检测方法。在CUMS造模四周后，Balb/c雌性小鼠体质量和糖偏好显著下降，糖偏好下降为快感缺失的体现，是抑郁症的核心症状，即提示抑郁症造模成功。负重游泳至竭力被广泛用于构建气虚模型[17]，并且研究也显示气虚模型的动物负重游泳时间降低[18]。模型小鼠负重游泳时间减少、抓力下降，此外掌纹血色度下降，皮毛评分增加。这与Balb/c雄性小鼠上观测到的一致[6]。气虚则力乏，表现为抓力下降。气为血之帅，气能行血，血的运行依靠气的推动作用，气虚则血行不足，精血不能输布于周身，皮毛失于荣养，表现为掌纹血色度下降、皮毛评分的增加，这一系列表现都支持Balb/c小鼠的气虚证候，而雌雄表现一致，更支持了遗传品系的稳定作用。

本研究显示对慢性应激后的Balb/c小鼠给予四君子汤1周后，与预测一致，抓力、掌纹血色比值、外荣皮毛能力及负重游泳时间等都提升了，从而改善Balb/c小鼠的气虚样证候及相关表现。更有意思的是，四君子汤能逆转模型小鼠糖偏好的降低与体质量的下降，对抑郁症具有显著的治疗效果，即对病也有效；以前还没有报道表明四君子汤的抗抑郁作用，其方药组成也缺乏急性抗抑郁活性成分，所以它对抑郁症的显著疗效应来源于对气虚证候或该证候与抑郁症疾病共同的病理因素的修正，提示了气虚证候与抑郁症的密切关系，说明Balb/c小鼠在慢性应激条件下气虚证候是基础性的，影响疾病发展的证候。从实验上支持中医辨证论治可以实现疾病治疗的效果。

已知脑区海马中的PKA-CREB信号通路与抑郁症有关，而该通路在外周还与气虚证有关。本研究发现造模四周后小鼠在海马和肌肉中PKA-CREB信号通路表达均下调，说明慢性应激对该品系小鼠的脑和外周都产生了信号缺陷。已有研究表明CUMS模型动物的海马中PKA-CREB信号通路表达下调[8]，对气虚证大鼠的研究表明其外周组织PKA-CREB信号表达下调[9-10]，而四君子汤可使其蛋白表达上调。但是还没有见到同时检测疾病与证候相关的分子机制的报道。本研究中，给予四君子汤后，模型小鼠肌肉和海马中PKA-CREB信号表达均明显增加，提示PKA-CREB信号通路可能参与到四君子汤改善气虚证候治疗抑郁症中，也为此模型下Balb/c小鼠的气虚证候特点提供了分子层面的依据。

本研究首次对疾病模型下的证候表现进行了中药反证，确立了在Balb/c小鼠上使用单一的CUMS抑郁症造模可获得稳定的气虚样证候，具有良好的重复性，可用于相关抑郁症病证结合的中医药研究和开发，也可以延展到其他类型的病证研究。今后从Balb/c与其他品系对照，及多种方药对照，多种疾病造模对照等方面进行研究，可以进一步廓清证候表现的特异性等。本研究首次基于易感性的遗传学来源，使用方药反证并检测病证相关的分子信号物质基础，结果支持了遗传对证候差异的重要影响及证候的易感性，初步揭示了病证之间深刻的内在联系，为探索证候本质与病证关系指出了新的方向。

参考文献:

[1] 周国儿，吴静，黄云娟，等．“肝郁气滞”及“肝郁脾虚”型抑郁症动物模型建立初探[J]．中华中医药学刊，2014,32(5)：1035-1038．

[2] 赵慧辉，王伟．病证结合证候模型研究基本思路[J]．中华中医药杂志，2006,21(12)：762-764．

[3] BOADIE WD, STEVEN P, NEMEROFF CB, et al. Differential change on depressive symptom factors with antidepressant medication and cognitive behavior therapy for major depressive disorder[J]. J Affect Disord, 2018, 229(15): 111-119.

[4] 唐启盛，曲淼，包祖晓，等．抑郁症中医证候的贝叶斯网络研究[J]．中医杂志，2008, 49(11)：1013-1015．

[5] 徐春燕，田金洲，时晶，等．抑郁症的中医证候特征研究[J]．中华中医药学刊，2013,31(4)：810-813．

[6] 周欣，薛文达，李守雪，等．不同抑郁症模型下证候差异的品系依赖性研究[J]．世界科学技术-中医药现代化，2016,18(2)：151-156．

[7] 王旭东，乔明琦，张樟进，等．中医药治疗抑郁症的研究进展[J]．南京中医药大学学报，2016,32(1)：93-96．

[8] 余汇，陈佳佳，曾冰清，等．cAMP/CREB/BDNF信号通路在沃替西汀抗小鼠抑郁样行为中的作用[J]．南方医科大学学报，2017,37(1)：107-112．

[9] 方肇勤，潘志强，卢文丽，等．大鼠、小鼠辨证的思路与方法[J]．中国比较医学杂志，2009,19(10)：53-59．

[10] 卢文丽，方肇勤，潘志强，等．小鼠气、血、阴、阳、虚等八种模型四诊的比较和评价[J]．中国中医基础医学杂志，2006,12(6)：433-438．

[11] 徐海军,陶文众,彭欢欢,等.黄芪多糖和葡萄籽提取物对衰老模型小鼠负重游泳时间和血常规参数的影响[J].天然产物研究与开发,2015,27(1)：158-162.

[12] 陈刚，周欣，薛文达，等．全基因组关联分析在中医证候研究中的应用展望[J]．中国中医基础医学杂志，2017,23(1)：141-143．

[13] 董昌武，高尔鑫．论疾病易感基因多态性与中医证候的多样性[J]．中华中医药学刊，2009,27(11)：2355-2356．

[14] WILLNER P, TOWELL A, SAMPSON D, et al. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a tricyclic antidepressant[J]. Psychopharmacology (Berl), 1987, 93(3): 358-364.

[15] MONLEON S, D'AQUILA P, PARRA A, et al. Attenuation of sucrose consumption in mice by chronic mild stress and its restoration by imipramine[J]. Psychopharmacology (Berl), 1995, 117(4): 453-457.

[16] WILLNER P. The chronic mild stress (CMS) model of depression: History, evaluation andusage[J]. Neurobiol Stress, 2017, 6(6): 78-93.

[17] 甘加宽，樊憬懿，王冬芝，等．睡眠剥夺诱导小鼠气虚证模型的方法研究[J]．世界科学技术-中医药现代化，2016,18(10)：1801-1806．

[18] 成映霞，段永强，杜娟，等．脾气虚大鼠小肠组织钙调蛋白信号通路中钙调蛋白,钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ基因表达规律的研究[J]．中医研究，2014,27(12)：51-56．