被子植物中，雄蕊发育代表着孢子体世代和配子体世代之间的密切相互作用，在植物繁殖过程中发挥着决定性的作用。雄配子体在花药小室内发育，二倍体孢子体在经历减数分裂后，有两个连续的有丝分裂过程。干燥的、新陈代谢相对静止的成熟花粉从花药中释放到柱头并萌发，花粉管进入花柱生长到胚珠，进而实现双受精。除在有性生殖方面展示出重要性外，花粉也是一种有趣的模型系统，它整合了细胞分裂、分化、命运决定、极性建立、细胞识别和通讯等基本细胞过程。目前，通过多学科的研究方法，包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学等对花粉的功能展开研究。

MDT模式带来的医疗技术的提高毋庸置疑。此外，中山医院门诊部主任崔彩梅还专门统计过，最近三年中，中山医院所有MDT门诊的投诉率是零。

花粉作为授粉过程中重要的因子之一，其是否能够在花柱中正常生长下去取决于被子植物界广泛存在的一种重要的生殖隔离机制——植物自交不亲和性(self-incompatibility，SI)，植物自交不亲和性的存在能够阻止基因型相同的花粉管在雌蕊中正常生长和完成受精。有研究显示，花粉和花柱的识别模式类似细菌侵染引起的生物反应[1]。此外，在自交不亲和反应中，也涉及到很多植物体内病原防御相关的蛋白质，如富含亮氨酸元件的受体激酶(FLS)，LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EFR)[2]。花柱识别自花/异花花粉机制与植物体区分伤害和外来病原的入侵机制类似。在自交不亲和识别过程中，当外界物质(花粉)进入柱头后，柱头中S-RNase表达水平的变化可能作为一种信号存在[3]。因此，有研究者推测，SI由病原防御进化而来[4]。同时，授粉时间不同导致KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集程度不同，假设亲和性和不亲和性花粉管在授粉的起始阶段就作为外源性的入侵物质被识别，在后来持续的花粉—花柱信息交流的过程中，花柱识别不亲和的花粉为一种外源性入侵进而引发防御反应。相反，花柱在亲和性授粉中防御反应会降低，从而花粉会被接受。在本研究中，‘植物—病原互作’通路及病原防御相关蛋白显著富集，包含Ca2+离子感应家族蛋白质、ARF鸟苷酸交换因子家族成员、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、bHLHs转录因子家族成员、富含亮氨酸重复序列受体蛋白激酶、HSP90家族成员等。推测‘植物—病原互作’通路在‘鸭梨’自交不亲和反应的识别过程中起到了重要的作用。为此，在iTRAQ(Isobaric Tag For Relative and Absolute Quantization)蛋白质定量测序技术对‘鸭梨’及其自交亲和性芽变‘金坠梨’花粉的差异蛋白质组学分析结果的基础上，笔者对自交亲和性状不同的2个梨品种花粉中病原防御相关蛋白质的有效数据进行分析，从蛋白质水平为深入研究自交不亲和机制提供参考依据。

（3）控释氮肥能够有效减氮稳产。各施肥处理的水稻产量之间没有显著性差异，控释氮肥处理水稻产量略高于尿素处理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本次研究中的试验材料‘鸭梨’(YL)及‘金坠梨’(JZ)花粉均在春天盛花期于田间采集，采集之前需套袋，以防止其他花粉污染，采集的花粉保存在-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2 蛋白质组学测定

1.2.1 花粉总蛋白质提取及定量 称取0.5 g样品，平均分装到2 mL离心管中，加100 g·L-1 PVPP和5 mm磁珠，再加入1.5 mL SDS L3，PMSF(终浓度1 mmol·L-1)和EDTA(终浓度2 mmol·L-1)混匀，置于冰上5 min后，加入DTT(终浓度10 mmol·L-1)；研磨破碎组织，取出磁珠，4 ℃，25 000×g离心20 min；上清转入50 mL离心管中，加入5倍体积的TCA/冷丙酮和DTT(终浓度10 mmol·L-1)，取沉淀，捣碎沉淀于-20 ℃放置过夜，次日4 ℃，15 000×g离心20 min；弃上清，沉淀转入2 mL离心管中，加1 mL冷丙酮和DTT(终浓度10 mmol·L-1)，捣碎沉淀于-20 ℃放置30 min后，4 ℃，25 000×g离心15 min，弃上清；重复上述步骤3次，直至上清无色；干燥沉淀，加适量裂解液、PMSF(终浓度1 mmol·L-1)、EDTA(终浓度2 mmol·L-1)混匀，置于冰上5 min后，加入DTT(终浓度10 mmol·L-1)后混匀；加适量裂解液和一颗5 mm磁珠，研磨促进蛋白质溶解，4 ℃，25 000×g离心15 min；取上清，加DTT(终浓度10 mmol·L-1)，56 ℃水浴1 h；冷却至室温，加IAM(终浓度55 mmol·L-1)，暗室放置45 min；5倍体积冷丙酮沉淀样品过夜，4 ℃，25 000×g离心15 min，弃上清；干燥沉淀，加200 μL裂解液和一颗磁珠，研磨促进蛋白质溶解，4 ℃，25 000×g离心15 min，上清即为蛋白质溶液。参照Bradford定量方法检测浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测样品完整性[5]。

植物在授粉过程中，花粉落在柱头上后首先与柱头表面接触，花粉萌发，花粉管伸长进入柱头，最后运输精细胞到胚珠中完成受精过程。研究发现，植物在授粉过程中会明显上调表达一些胁迫与防御相关的蛋白质。在水稻中发现一些调控因子同时调控柱头和一些胁迫相关基因，表明植物在授粉和胁迫防御反应两个生物学过程中存在交叉。在花粉萌发、花粉管延伸到生长等一系列过程中胁迫及防御相关蛋白均有参与，如参与花粉的粘附与萌发，诱导花粉管产生，调控花粉管停止生长、破裂并释放出精子的过程等[12～14]。

1.2.3 阳离子交换色谱分析 混合后的肽段样品溶于4 mL强阳离子缓冲液A(25 mmol·L-1 NaH2PO4，φ(乙晴)=0.25，pH 2.7)。使用高效液相色谱系统并装配强阳离子交换色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex)进行肽段分馏。缓冲液B(25 mmol·L-1 NaH2PO4，1 mol·L-1 KCl，φ(乙晴)=0.25，pH 2.7)用于流动相，流速设置为1 mL·min-1。分级梯度设置为缓冲液A 10 min；11 min内缓冲液B体积分数由0.05升至0.35；1 min 内缓冲液B体积分数由0.35升至0.80；缓冲液B的体积分数0.80保持3 min；缓冲液A平衡10 min。检测波长为214 nm，每分钟收集1个洗脱组分，共收集20个。随后，经C18反相色谱(Phenomenex)脱盐后真空冻干，-80 ℃保存。

德国布鲁克光学仪器公司(Bruker Optics Inc)的SENTERRA激光共焦显微拉曼光谱仪，配有制冷的CCD探测器和一个TV监视仪，可以使激光在样品上产生作用的各个部位清晰地显示出来。OPUS(verion.6.5; Bruker Optik GmbH, Germany) 光谱采集软件，Origin8.0画图软件和Unscrambler (verion. 10.1; CAMO AS, Trondheim,Norway)化学计量学分析软件。

1.3 数据分析

将原始质谱数据通过ProteoWizard工具转换成MGF格式后，利用蛋白质鉴定软件Mascot Server将原始质谱数据自动匹配到梨蛋白质数据库，包括NCBInr，SwissProt，UniProt等。采用自动分析软件IQuant进行蛋白定量分析，从定量结果中筛选出显著差异蛋白。

1.4 生物信息学分析

冬春季气温忽冷忽热，多雨潮湿，细菌、病毒容易孳生繁殖。而此时的畜禽往往由于饲养管理不当、气候温差变化大、更换饲料等各种应激导致体弱,抗病力下降，动物更容易发生各种疾病。冬春季生猪易发的传染病主要有以下几种。

在‘植物—病原互作’通路中，差异蛋白主要涉及到Ca2+离子感应家族蛋白质、ARF鸟苷酸交换因子家族成员、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、富含亮氨酸重复序列受体蛋白激酶、bHLHs转录因子家族成员以及HSP90家族成员等。

2 结果与分析

2.1 GO富集分析中病原防御相关蛋白

对JZ和YL花粉中鉴定到的489个差异表达的蛋白质经GO注释，并按照生物过程、分子功能及细胞组分的功能范畴进行分类。差异蛋白涉及22个生物过程、12种分子功能和13个细胞组分(图1)。所有鉴定蛋白中参与生物过程‘防御反应’的蛋白质占比2.7%，差异表达蛋白中参与‘防御反应’的蛋白质占比0.8%。其中鉴定到2个相关蛋白质：磷脂酶D γ1(gi|694450329)和MLP样蛋白423(gi|694361640)，二者在‘金坠梨’中均下调表达。

  

图1 差异表达蛋白GO功能注释结果

2.2 KEGG富集分析中病原防御相关通路

KEGG是系统分析基因功能以及基因组信息的数据库，有助于把基因及其表达信息以一个整体网络的形式展示。KEGG数据库注释的鉴定蛋白有3 236个，Pathway显著性富集分析显示这些蛋白参与了124条生物学代谢通路。在KEGG数据库中，所有鉴定蛋白中参与‘植物—病原互作’通路的蛋白质占比2.94%，差异表达蛋白中参与‘植物—病原互作’通路的蛋白质占比3.95%。

2.3 ‘植物—病原互作’通路相关蛋白表达分析

抑制型鸟苷酸交换蛋白(Inhibited guanine nucleotide-exchange protein)是ARF(ADP核糖基化因子，ADP-ribosylation factor)鸟苷酸交换因子(Guanine nucleotide-exchange factor，GEF)家族成员，主要位于高尔基体。ADP核糖基化因子是最先报道的一种小G蛋白，它在细胞骨架的装配和蛋白质的小泡运输中起着重要的作用[17]。对苹果砧木干旱胁迫响应的分子机理研究显示，在干旱胁迫条件下，Brefeldin A抑制型鸟苷酸交换蛋白上调表达[18]。GNL2仅限于在雄配子体中表达,预测与花粉特异性有关[19]。本次研究中，3种Brefeldin A抑制型鸟苷酸交换蛋白(gi|694388021，gi|694440459和gi|694356036)以及另外1种ARF鸟苷酸交换因子(GNL2-like，gi|694417790)在‘金坠梨’花粉中均下调表达，其下调表达与自交亲和反应的联系尚需进一步深入研究。

  

图2 ‘金坠梨’和‘鸭梨’花粉蛋白质组‘植物—病原互作’通路

 

表1 本次研究中‘植物—病原互作’通路相关蛋白质

  

序号基因ID蛋白名称简写 表达情况 (JZ vs YL)1gi|694413736Probable receptor-like protein kinase At5g39020BAK1上调2gi|694330727Mitogen-activated protein kinase 9-likeMAPK下调 3gi|694435666Calmodulin-7CAM上调 4gi|694323180Putative transcription factor bHLH041 isoform X2MYC2下调 5gi|694439617Probable calcium-binding protein CML21 CML下调 6gi|694321080Serine/threonine-protein kinase sepA-likeMEKK1下调 7gi|694316668Endoplasmin homologHSP90上调 8gi|694417790ARF guanine-nucleotide exchange factor GNL2-likeGeFs下调 9gi|694321205leucine-rich repeat receptor-like protein kinase At1g35710FLS2上调 10gi|694440459Brefeldin A-inhibited guanine Nucleotide-exchange protein 2-likeMIN7下调 11gi|694400374Calcium-dependent protein kinase 11 CDPK下调 12gi|694356036Brefeldin A-inhibited guanine Nucleotide-exchange protein 1-likeMIN7下调 13gi|694367347Probable calcium-binding protein CML13CML上调 14gi|694388021Brefeldin A-inhibited guanine Nucleotide-exchange protein 5-likeMIN7下调

Where: Ls is system length of escalator; ROUNDUP is rounding function; 0.5 is loss rate of material; 2 means two sides.

3 讨 论

植物的先天免疫系统大致可以分为两个层面。第一个层面是通过植物细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)识别病原物相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)的免疫过程, 被称为分子模式触发的免疫(Pattern-triggered immunity，PTI)[6,7]。PAMPs只由微生物产生，不存在于宿主植物中，因此植物可以通过细胞膜表面的识别受体PRRs将其识别为“非我”成分，做出适当的免疫应答[8,9]。第二个层面，少数适应性病原物(Adapted pathogen)利用效应子(effector)抑制植物PTI反应，抑制植物的基础抗性来增强致病性，再次实现对植物的侵染，称为效应子触发的免疫反应(Effector-triggered immunity，ETI)[10]。蛋白质、RNA和代谢产物都可以作为效应子发挥作用。有些效应子具有酶活性, 通过修饰宿主蛋白来增强病原物的致病性，有些效应子作为转录因子下调宿主防卫反应基因的表达[11]。

1.2.2 蛋白水解和iTRAQ标记 取样品各100 μg，按照m(样品)∶m(试剂)=20∶1加入Trypsin Gold(Promega)，37 ℃孵育4 h。随后，补加Trypsin Gold，37 ℃继续孵育8 h。真空离心至干燥。用0.5 mol·L-1 TEAB重新溶解肽段。根据OD280值分别取YL和JZ样品各约80 μg，按照iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit说明书进行标记，将标记后的各组肽段混合。

植物钙结合蛋白在调控花粉发育及花粉管生长方面发挥重要作用。CAM蛋白参与梨花粉萌发的调控过程，可能是通过调控花粉细胞内游离Ca2+浓度的动态变化，产生特异性的钙信号来实现的，花粉管伸长依赖于花粉管尖端的Ca2+浓度梯度[15]。Franklin-Tong等[16]进行的研究表明，SI反应引起不亲和花粉管内胞质游离Ca2+浓度在几秒钟内迅速升高，触发不亲和花粉管内具有几个靶标的信号网络，导致花粉管尖端生长被迅速抑制和不亲和花粉的最终死亡。‘金坠梨’中Ca2+离子感应家族蛋白质，包括钙结合蛋白CML13(gi|694367347)和钙调素calmodulin-7(gi|694435666)表达上调，而另外一种钙结合蛋白CML21(gi|694439617)表达下调。除了钙调素蛋白和类钙调素蛋白下调表达，一种Ca2+依赖蛋白激酶(gi|694400374)表达同样下调。‘金坠梨’花粉中Ca2+离子感应家族蛋白质可以通过调节钙离子浓度影响自交不亲和反应。

差异蛋白进行GO注释(Gene Ontology，http://www.geneontology.org/)，并且按照生物过程、分子功能及细胞组件的功能范畴进行分类。差异蛋白通路富集分析与KEEG数据库进行比对(http://www.genome.jp/kegg/)，获得相对应的Pathway注释信息。对‘植物—病原互作’通路中涉及到的差异表达蛋白质进行统计分析。

1.2.4 LC-ESI-MSMS鉴定 采用LC-20AD纳升流速HPLC液相系统(nanoHPLC，Shimadzu，Kyoto，Japan)进行分离。分离后利用TripleTOF 5600系统(AB SCIEX，Concord，Canada)结合纳升喷雾Ⅲ离子源(AB SCIEX，Concord, Canada)进行质谱分析。扫描模式为IDA，一级TOF-MS单张图谱扫描时间为250 ms，每次IDA循环时间固定为3.3 s，碰撞室能量设定为Collision-induced Dissociation，动态排除设置为15 s。

对本次研究中‘植物—病原互作’通路中涉及到的差异表达蛋白质进行了统计(图2)，并标注了其在‘金坠梨’和‘鸭梨’中的定量表达调整情况(表1)。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在本研究中也涉及较多。促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)是普遍存在于真核生物中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。植物MAPK信号途径在植物生长发育以及逆境胁迫响应和激素调控过程中发挥着重要作用，参与细胞周期调节等信号传递，也是钙离子信号传导下游的一个正调控因子[9,20]。拟南芥促分裂原活化蛋白激酶AtMPK3/6不仅参与植物抗病和抗逆反应，并且在花粉、胚珠等发育过程中起关键性作用[21～23]。受体样蛋白激酶RLKs直接参与信号的跨膜转移作用，在应答光、病原侵袭、生长调节因子、温度胁迫和营养缺乏等信号传导方面起到重要作用。而蛋白组数据中促分裂原活化蛋白激酶(gi|694330727)以及sepA-like丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(gi|694321080)在‘金坠梨’花粉中均下调表达，该类蛋白与自交不亲和的具体作用机制尚不清楚。

一种富含亮氨酸元件受体样蛋白激酶At1g35710在‘金坠梨’花粉中上调表达。研究表明，富含亮氨酸重复序列受体蛋白激酶(Leucine-rich repeat receptor-like protein kinase, LRR-RLK)是植物受体蛋白激酶家族中最大的一个分支，该基因家族基因广泛参与植物器官发生、形态建成、逆境胁迫应答等多种信号传导过程，在植物生长发育中发挥着重要功能。

植物bHLHs(Basic helix-loop-helix proteins)转录因子家族的部分成员可通过激活或抑制一些花发育相关基因的时空特异性表达进而调控植物的雄花发育。目前在拟南芥、玉米、水稻等植物中的研究发现某些雄性不育现象与特异bHLH转录因子的功能异常有关[24～29]。此外，bHLHs转录因子还参与调控植物的生长发育、生物和非生物胁迫、元素吸收等多种生物学过程[30]。本次研究中bHLH041转录因子在‘金坠梨’花粉中下调表达，是否与‘金坠梨’花粉部分败育相关需要进一步的试验验证。Poulter等[31]通过对罂粟属自交不亲和诱发的细胞骨架蛋白变化的研究发现，在自交不亲和(SI)样品与亲和样品中，热激蛋白和分子伴侣在SI样品中表达量更高，有5个HSP90家族成员热激蛋白/分子伴侣蛋白在SI样品中特异性表达，说明这些热激蛋白可能在自交不亲和中发挥作用。SI触发不亲和花粉的胁迫应答，其中牵涉到热激蛋白及分子伴侣，表明热激蛋白可能在自交不亲和反应中发挥作用。本次研究中，HSP90家族蛋白(gi|694316668)以及两个辅助伴侣蛋白HSP10(gi|694423792和 gi|694392691)在‘金坠梨’花粉中均上调表达，可能参与了授粉的识别过程。

本次研究结果显示，蔷薇科果树自交不亲和反应还涉及到一些其他胁迫相关蛋白，包括推测的防御素defensin Ec-AMP-D1-like(gi|694332999)，2个KIN2应激蛋白(gi|694396918和gi|694396914)、一种创伤诱导性碱性蛋白(WIPs，gi|694393601)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)以及萌发素类蛋白(GLP)等。GLP是花粉特异表达蛋白质，其家族蛋白质普遍存在于高等和低等植物中，参与生物与非生物胁迫反应[32]。GSTs是一种抗氧化酶，在拟南芥中能够帮助维持体内ROS平衡[33]。在陆地棉花药中超表达GST基因提高了花粉的可育性，说明GSTs可能与花粉的可育性和花粉的发育相关[34]。本次研究中，2个谷胱甘肽-S-转移酶(gi|694435489和gi|694415466)均上调表达，推测‘金坠梨’通过提高花粉中GST的表达水平进而升高GST酶活性，清除活性氧和膜修复能力提高，活性氧对生殖细胞的损伤减弱，育性提高。

1981年 国家调拨100亿斤粮食支援发展食品工业。《全国食品工业发展纲要》制定，为我国食品工业的前行指明了方向。

有研究表明，‘植物激素信号转导’通路协同‘植物—病原互作’通路在植物自交不亲和过程中发挥着重要的作用[35]。花粉与柱头互作可能是多条信号通路共同完成，即一种蛋白可能参与多条信号通路，多条信号通路可以共同发挥作用以完成此项生命活动[36]。本次研究中，在‘植物—病原互作’通路中的分裂原活化蛋白激酶(gi|694330727)、受体样蛋白激酶At5g39020(gi|694413736)和bHLH041转录因子同样也参与到了‘植物激素信号转导’通路，印证了上述说法。

综上所述，本次研究综合比较了自交不亲和性‘鸭梨’及其自交亲和性芽变‘金坠梨’花粉的蛋白质组，鉴定得到了一些可能参与自交不亲和反应的病原防御相关的差异蛋白，包括Ca2+离子感应家族蛋白质、ARF鸟苷酸交换因子家族成员、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、富含亮氨酸重复序列受体蛋白激酶、bHLHs转录因子家族成员以及HSP90家族成员等。自交不亲和相关的KEGG通路分析显示，‘植物—病原互作’通路得到显著富集，直接或者间接参与了自交不亲和的识别过程。

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