0　引　言

绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)属革兰阴性菌，具有广泛分布于自然界和多药耐药性的特点，是临床上较常见的条件致病菌，引起化脓性病变以及各种继发性感染[1].绿脓杆菌分泌大量的代谢产物，其中绿脓菌素(Pyocyanin，PCN)具有氧化还原活性和容易穿过细胞膜的特点[2-3]，而且在绿脓杆菌肺部感染患者痰液中绿脓菌素的浓度可高达27 μg/ mL [1].Chung等研究发现，分泌绿脓菌素的菌株与缺乏绿脓菌素的菌株相比，更显著地引起NK92细胞的凋亡，但是其绿脓菌素引起自然杀伤细胞凋亡的机制还不清楚[4].

自然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK cell)是机体重要的免疫细胞，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等方面起到至关重要的作用[5].在小鼠体内消耗NK细胞后感染绿脓杆菌时，明显促进小鼠死亡率[ 6].NK细胞在绿脓杆菌感染时的作用在临床日益受到重视[7].在绿脓杆菌感染时NK细胞发生凋亡而细胞数量和百分比减少[4，6].

细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下遵循的程序性死亡过程.细胞凋亡的信号通路主要有两条途径：一条是通过细胞膜受体的激活引起的细胞外通路；另一条是通过线粒体的损伤而引起的细胞内通路.线粒体是细胞内产生能量的重要细胞器，是细胞生存与死亡的调节中心.Bcl-2 家族蛋白能引起线粒体膜电位的改变而造成线粒体的损伤，从而诱导细胞凋亡[8].

为了阐明绿脓菌素引起NK细胞凋亡的机制，利用绿脓菌素化合物刺激NK92细胞株，观察是否改变线粒体的膜电位和促凋亡蛋白的表达,以此来研究绿脓菌素引起细胞凋亡的分子机制.

1　材料和方法

1.1　主要材料

NK92细胞株(CRL-2407TM)购自美国ATCC(American Type Culture Collection)细胞库；PCN购于Cayman Chemical (10009594); CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒购于Promega(G1780)；Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(C1063)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(C2006)和BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)购于碧云天生物技术；β-actin (#3 700)和促凋亡Bcl-2家族抗体试剂盒(Pro-Apoptosis Bcl-2 Family Antibody Sampler Kit，#9 942)购自Cell Signaling Technology.

1.2　NK92细胞的培养

培养NK92细胞用α-MEM培养液(GNM11900，基诺生物)，加20%胎牛血清(11012-8611，四季青)和10 μg/ L的白细胞介素-2(IL-2)(200-02，PeproTech Asia).NK92细胞特点是集合在一起生长，当细胞密度过高或培养液耗尽的时候细胞就变为分散，将会失去活力.

在我国当前的煤矿建设和生产中，为了将整体的煤矿工程建设生产能力提升上来，在进行煤矿工程的建设中都已经将轨道运输建设到了煤矿矿井内部，借助煤矿轨道运输体系的运行，全面提升了煤矿生产运行效率。但是由于在轨道运输中需要对轨道运输状况进行监督，以此提升轨道监督控制效果。实践证明通过智能综合监控系统应用能够实现对整个煤矿轨道运输监控，对于提升煤矿生产运行效率具有重要性保障。本文以煤矿轨道运输智能综合监控系统设计与应用为研究对象，结合冀中能源股份有限公司东庞矿系统设计应用概况进行了分析，对于提升该煤矿轨道运输能力具有重要性研究意义。

1.3　细胞毒性实验

CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒可用于检测乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)的含量.细胞膜损伤而释放出来的乳酸脱氢酶在培养基上清液中，与四唑盐底物偶联酶学反应后液体变成红色.红色产物的吸光度与细胞死亡成正相关.通过所测得的吸光度值，计算出细胞死亡相对百分比.

细胞毒性

实验组处理不同浓度的绿脓菌素；正常组没有加任何刺激物；最大细胞死亡组为处理0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100).24 h后收集细胞上清液，测定各组细胞样品中LDH的量，方法如下：96孔培养板中加入50 μL的细胞上清液，再加50 μL配制好的底物混合物(详见说明书)，在室温避光孵育30 min后加入反应终止液，在490 nm波长记录吸光值.用样品读数值按照公式计算细胞毒性百分比.

1.4　细胞凋亡实验

收集正常培养组、DMSO溶剂对照组和不同浓度的绿脓菌素处理24 h后的NK92细胞，600 g离心5 min，倒去上清液.加入1 mL的1×PBS，600 g离心5 min清洗细胞一次.用准备好的1×Annexin V结合液制备细胞终浓度为1×106cells/mL的细胞悬液.取100 μL加入流式细胞仪专用离心管中，并加入5 μL的Annexin V-FITC和5μL的PI探针.室温下避光孵育15 min后，补充加入400 μL的 1×Annexin V 结合液，插入冰中.用流式细胞仪在1 h内检测Annexin V-FITC(FL1通道)和PI(FL2通道)双染色阳性细胞的百分比.

本文采用的标注提取分析软件为MAT1．3，有效地对各目标语言特征进行标注和统计。为了规避美国新任总统特朗普强烈的个人风格的影响，对比语料采用的是奥巴马2016年《美国国情咨文》。此处年度因素对于语体特征的影响要远小于个人风格的干扰。通过软件生成数据，整理后我们选取了十种常见的体裁作参照。

第三，新媒体赋予我们行动与实践的权力。表达本身就是一种行动，这里的行动强调表达与现实的行动相结合[9](P13)，强调虚拟与现实的结合与行动。新媒体通过信息赋权使得每个个体都有可能成为自由表达的主体，然后通过交互行为快速地将表达转化为实践，线上活动和线下活动的结合，最大可能地打开了现实行动的空间，推动了传统信息传播中难以达到的实践改革。

1.5　线粒体膜电位检测实验

利用JC-1线粒体荧光探针检测线粒体的膜电位.在正常细胞线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，发出强烈的红色荧光；而在线粒体损伤中发生跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放到细胞质，转变为单体而发出绿色荧光.因而，颜色的变化可以直接反映出线粒体膜电位的变化.

绿脓杆菌是一种常见的革兰阴性的临床病原菌，可诱导多种细胞的凋亡.其代谢产物绿脓菌素易穿过细胞膜，是机体细胞主要的毒性物质[1-2].但是，绿脓菌素引起NK92细胞凋亡的作用机制尚未有文献报道[4].

1.6　免疫印迹实验

综上所述，本实验组认为绿脓菌素促进Bcl-2家族促凋亡蛋白的激活，引起线粒体膜电位的降低，从而导致线粒体损伤依赖性的NK92细胞的凋亡.

2　结果与分析

2.1　绿脓菌素诱导NK92细胞凋亡

参考文献:

现代技术的累积性、繁殖性和跨学科整合发展等特征，势必对人、社会、自然和未来都将带来深远的影响，技术影响力在时空上的延伸也要求道德责任突破原有时空中人和事，指向时间和空间上遥远的人、自然和社会。因此，技术时代的人除了要承诺较为确定的近距离责任外，更重要的是还要主动担负起预见性责任，即对尚未发生的事态（尽管尚未发生，但由于人类今天的选择使得它们在将来有很大的发生可能性）和尚未出生的后代负责，这是产生于传统社会的儒家责任观所未能涉及的责任域。

 

A：24 h后收集各实验组的细胞培养上清液，检测乳酸脱氢酶活性； B：收集细胞，用流式细胞仪观察Annexin V/PI阳性细胞的百分比.Media组为正常培养组，DMSO组为溶剂对照组，Triton X-100组为阳性对照.每个实验重复做3次.

图1　绿脓菌素引起NK92细胞的凋亡Fig.1　Pyocyanin induces NK92 cells apoptosis

2.2　绿脓菌素激活NK92细胞线粒体膜的促凋亡蛋白

 

A：24 h后收集各实验组的细胞用JC-1(1.0 μg/mL)荧光探针检测线粒体膜电位的变化； B：24 h后收集各实验组的NK92细胞，提取蛋白质做免疫印迹实验，观察线粒体膜的促凋亡蛋白Bak、Puma、Bad、Phospho-Bad、Bik和Bax.Media组为正常培养组，DMSO组为溶剂对照组，PCN为绿脓菌素.每个实验至少重复做3次.

图2　绿脓菌素激活线粒体膜的促凋亡蛋白Fig.2　 Pyocyanin activates mitochondrial pro-apotptic protein

[3] RESZKA K J, O'MALLEY Y, MCCORMICK M L, et al. Oxidation of pyocyanin, a cytotoxic product from Pseudomonas aeruginosa, by microperoxidase 11 and hydrogen peroxide [J]. Free Radical Biology & Medicine, 2004, 36(11): 1448-1459.

3　讨论

具体操作步骤如下：正常培养组、DMSO溶剂对照组和不同浓度的绿脓菌素处理24 h后的NK92细胞，重新悬浮于0.5 mL的细胞培养液中，加入试剂盒中JC-1染色工作液0.5 mL，颠倒数次混匀后在细胞培养箱中孵育20 min.孵育结束后，600 g离心5 min，收集细胞.用配制好的JC-1染色缓冲液(详见说明书)洗涤2次，再用适量JC-1染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪分析红色和绿色荧光细胞的百分比.

将NK92细胞分为6个组，每组细胞数为4.0×105.Media组为正常培养组、DMSO组为溶剂对照组、绿脓菌素刺激浓度为10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L.将细胞置于37 ℃恒温箱中孵育24 h后，收集上清液和细胞.

细胞凋亡是细胞在一定条件下接受刺激信号并受基因调控的一种自主性、程序性死亡过程.关于细胞凋亡主要有死亡受体介导的细胞外信号通路和线粒体介导的细胞内信号通路[8].绿脓菌素很容易穿过细胞膜而进入细胞质内，没有相应细胞膜的受体[2].因此，为了研究绿脓菌素如何诱导NK92细胞凋亡，本实验主要着眼于线粒体依赖的细胞内凋亡信号通路.经研究发现，绿脓菌素引起NK92细胞的凋亡是通过线粒体的损伤.

Bcl-2家族蛋白在调节线粒体膜的通透性和完整性起重要调控作用.Bcl-2家族蛋白可以分为抗细胞凋亡的蛋白和促细胞凋亡的蛋白两类，这些蛋白不同程度的镶嵌在线粒体膜上，调控线粒体膜的通透性[8].为进一步探讨NK92细胞线粒体损伤的分子机制，本实验采用免疫印迹方法观察了线粒体膜的促凋亡蛋白的表达.结果发现在绿脓菌素的刺激下，NK92细胞线粒体表面蛋白Bak，Phospho-Bad，Bik被激活，Puma蛋白呈先升后降的趋势，Bax蛋白无明显变化.通过本实验发现绿脓菌素可以激活线粒体膜的促凋亡蛋白.

收集正常培养组、DMSO溶剂对照组和不同浓度的绿脓菌素处理24 h后的NK92细胞，600 g离心5 min沉淀细胞，倒去上清液.每个离心管中加入100 μL RIPA细胞裂解液(1 mL的RIPA裂解液中加入10 μL 磷酸酶抑制剂和10 μL的PMSF)，放冰上裂解30 min后，12 000 rpm离心30 min收集上清的蛋白质.用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010；碧云天)测定蛋白质浓度.准备等量的蛋白质样品与一倍的上清样缓冲液混匀，置于100 ℃反应5 min后马上在冰上冷却.准备好的蛋白样品在100 V电压条件下电泳，100 V电压进行转膜60 min把蛋白质转到PVDF膜上.转膜完成后加入BSA封闭液封闭1 h后用于孵育抗体.促凋亡Bcl-2家族抗体稀释1∶1 000，用于检测线粒体膜促凋亡蛋白的表达. β-actin抗体稀释1∶1 000，作为上样量内参蛋白的检测.

NK92细胞是人的自然杀伤细胞株，广泛应用于自然杀伤细胞分子机制的研究.NK92细胞往往呈悬浮和多细胞聚集生长.刺激绿脓菌素后发现，NK92细胞不能聚集成团并存在很多细胞碎片.乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)是细胞质内存在的酶，当细胞膜裂解时才被释放出来，是检测细胞死亡的指标.收集细胞的上清液检测乳酸脱氢酶活性发现，随着绿脓菌素刺激浓度的增加而酶活性也显著增加(图1A).分泌绿脓菌素的菌株与缺乏绿脓菌素的菌株相比，更显著地引起NK92细胞的凋亡[4].本实验用收集的细胞还检测了Annexin V/PI阳性细胞的百分比，发现随着细胞培养上清液中乳酸脱氢酶活性的增加，NK92细胞的Annexin V/PI阳性细胞的百分比也在增加，当刺激浓度为200 μmol/L时可增加到3倍(图1B).由此可以判断绿脓菌素引起的NK92细胞的死亡是由细胞凋亡引起的.

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[2] MULLER P K, KROHN K, MUHLRADT P F. Effects of pyocyanine, a phenazine dye from Pseudomonas aeruginosa, on oxidative burst and bacterial killing in human neutrophils [J]. Infect Immun, 1989, 57(9): 2591-2596.

绿脓菌素容易穿过细胞膜，而且可以诱导线粒体依赖性的中性粒细胞凋亡[2]. 因此，为了观察绿脓菌素是否诱导NK92细胞的线粒体损伤，本实验利用JC-1分子探针检测线粒体膜电位.研究发现，随着绿脓菌素刺激浓度的增加，红色荧光细胞百分比逐渐减少，而绿色荧光的细胞百分比显著增加到2倍以上(图2A).此外，本实验经免疫印迹实验方法观察线粒体膜的促凋亡蛋白，发现Bak、phospho-Bad 和Bik促凋亡蛋白的表达随着绿脓菌素刺激浓度而增加，而Puma蛋白在10 μmol/L时开始表达，在50 μmol/L开始消失(图2B).由此可以确定，绿脓菌素引起NK92细胞线粒体的损伤是通过激活线粒体膜的促凋亡蛋白.

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例如在小学阶段，教师需要能够结合课堂当中的一切条件，针对学生进行英语语素的传递，并让学生产生多种感受，形成语感。家长也可以在过程中配合学习，通过参加英语夏令营等互动，逐步引导学生，培养学生形成音素认识。

[7] GIAMARELLOSBOURBOULIS E J. Natural killer cells in sepsis: detrimental role for final outcome [J]. Critical Care Medicine, 2014, 42(6): 1579-1580.

准公益性的坑塘建设资金主要来源于政府补贴和信贷，涉农金融机构是向农村注入农民贷款资金的主渠道，由于国家金融机构的商业化经营行为，出现离农倾向，使农村大量资金向城市逆向流动。例如中国邮政储蓄银行储蓄65%的资金来源于农村，但几乎90%以上的资金，通过转存央行或者以办理存款方式转存城市商业银行等途径，造成资金从农村向城市的逆向流动，导致农村资金匮乏，贷款难成为准公益坑塘建设的制约因素。

教学内容的表现形式多样，我们选用的教材是自编教材《基本护理技术》,本书鲜明的特点是在与医院充分合作的基础上，基于工作过程开发教材，在结构上体现为以任务为载体、以项目为导向。选用的辅导教材有自编教材——护理实训指导书、《执业护士资格考试考点精编》等，建立了《基本护理技术》精品课程网络平台，各类电子资源等均已陆续上网。

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本文水、气体渗透实验的理论依据为Darcy定律。采用图4所示水(气体)渗透试验装置，利用稳定渗流法测定混凝土试件的水(气体)渗透系数[17-18]。