0　引　言

柑橘果实因其柔嫩多汁、富含Vc及其他活性化合物，如黄酮类、酚酸类等，是人们日常生活喜爱的水果佳品.柑橘类水果在国际水果贸易中占据极重要的地位.2008年，中国超过巴西，成为世界柑橘产量最大的国家.尤其在中国南部地区，如浙南、闽西、粤东等，柑橘是当地最重要的也是最流行的水果之一.然而，由于柑橘在采收及运输过程中容易产生伤口，并且柑橘果实水分含量高，因此在柑橘的采后贮藏过程中，各种病原真菌容易侵染果实而导致柑橘病害的发生，给世界各地柑橘产区带来巨大的经济损失[1].

最常见的柑橘病害包括由指状青霉Penicillium digitatum引起的绿霉病和由意大利青霉Penicillium italicum引起的青霉病.其中，P. digitatum引起的柑橘绿霉病导致的腐烂损失最大，约占柑橘果实贮藏过程中总损失的90%[2].目前防治柑橘绿霉病最主要的方法是采用合成杀菌剂.然而，合成杀菌剂对人畜和环境的副作用，已逐渐被消费者所关注.因此，科研工作者们正在寻找开发能够有效控制绿霉病害、而且不会引起其病原真菌P. digitatum抗性增加的非合成杀菌剂类物质 [3-5].

近年来，一些被称为“公认安全的化合物”(GRAS)以及天然存在的植物成分因其具有较好的抗真菌作用而被研究者关注.已有研究发现，硼酸、亚磷酸盐、碳酸氢钠、肉桂油、癸醛等具有开发成果蔬采后保鲜剂的潜力.硼酸(BA)是硼的一元弱酸，化学式为H3BO3，以无色晶体或白色粉末形式存在且溶于水.它经常被用作防腐剂、杀虫剂和杀真菌剂的活性成分或作为必要组分用于治疗或预防植物中硼的缺乏[6].根据美国联邦疾病防控中心有毒物质与疾病登记处的规定，对于成年人，BA的致死剂量为5-20 g /kg体重.因此，在实际应用中如果使用得当，BA被认为是安全的、环境友好的.近年来，BA及其盐被提议用作采后杀真菌剂和水果保鲜剂.已有报道表明，BA能抑制Venturia inaequalis诱发的苹果黑星病[7]、Eutypa lata引发的葡萄顶枯病[8]、Botrytis fabae Sard引发的蚕豆赤斑病[9],BA还能降低5 ℃冷藏条件下Botrytis cinerea诱发的苹果灰霉病发病率等[10].同时，在体外抑菌实验中，0.1%、1%及0.075%(w/v)的硼酸盐能分别显著抑制果蔬采后病原真菌Penicillium expansum、Botrytis cinerea及Monilinia laxa的发育[11-13].

本研究分离自然发病的柑橘绿霉菌，并通过生理、生化指标(孢子萌发率、芽管伸长速度、生物量、菌落扩展速度、活体接种发病率及病斑直径)测定，确定BA处理对P. digitatum生长发育的影响.本研究为采后病原菌的防治提供了新的思路.

2.2.2.2 药剂喷雾在发病初期，用58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂400倍液，或用75%百菌清可湿性600倍液，60%百菌通可湿性粉剂400～500倍液，64%杀毒矾可湿性粉剂500倍液，或用72%杜帮克露可湿性粉剂600倍液，72.2%普力克水剂600倍液。

他们围着云浮山的山巅绕了一圈，先去了西边的望天归，又到了北面的鬼愁涧，再逛了东部下山的羊肠路，在路口站了一会儿，最后来在了南方的鹰翔崖。

1　材料与方法

1.1　实验材料及试剂

当法兰盘上的摄像窗及光源照射窗受筒形密闭容器内多相物料沾染模糊不清时，打开喷水清洗管的阀门，对摄像窗及光源照射窗进行喷水清洗，喷水清洗结束后，启动驱动电机，驱动电机带动磁力驱动盘旋转，磁力驱动盘利用磁力带动清洗盘旋转，通过清洗盘上的橡胶清洗条对法兰盘上的摄像窗及光源照射窗进行清刷.

4.电器以及导体的动稳定、热稳定和电器的短路开断电流，应该按照三相短路进行验算。一般用熔断器进行保护的电压互感器回路，对动稳定以及热稳定情况可以不进行验算。对断路器的断流能力进行校核时，采用的校核条件应该是断路器实际开断时间的短路电流。

1.2　Penicillium digitatum的分离及鉴定

菌丝生物量的积累是病原菌的生长速度及状态的重要指标，而作为异养微生物碳源的主要来源，培养基中的总糖变化反映着病原菌能量及物质代谢的状况.PDB培养基中培养12 h后，经1 g/L BA处理的指状青霉P.digitatum菌丝生物量与对照相比有明显减少(图4A).分别培养12 h、24 h、36 h、48 h后，1 g/L BA处理的P.digitatum菌丝生物量约为对照的50%、53%、50%、60%.总糖吸收率结果与菌丝生物量趋势基本一致，经1g/L BA处理组与对照组相比表现出明显的下降(图4B).分别培养12 h、24 h、36 h、48 h后，1 g/L BA处理的总糖吸收率约为对照组的25%、40%、47%、58%.综合菌丝生物量和总糖吸收率实验结果得知BA处理会抑制P.digitatum菌丝生物量积累并可能引起P.digitatum糖代谢障碍.

1.3　BA最低抑菌浓度的确定及其对P.digitatum芽管伸长的影响

将分离的病原菌P.digitatum接种在PDA培养基上，25±2 ℃培养1周，按上述方法收集孢子.将P.digitatum孢子悬浮液等量加入PDB培养基中，调节孢子终浓度为1.0×106 spores/mL，分别加入BA(最终质量浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2g/L).25 ℃、200 rpm振荡培养，分别在5、7、9、11h后用光学显微镜统计孢子萌发率，确定BA的最低抑菌浓度，并分别在培养11、13、15、17 h后利用显微镜镜头标尺测量最低抑菌浓度处理组P.digitatum芽管长度[14].

1.4　BA对P.digitatum总糖吸收率及菌丝生物量积累的影响

将病原菌P.digitatum接种在PDA培养基上，25±2 ℃培养2周，按上述方法收集孢子，并调节孢子终浓度为1.0×106 spores/mL.处理组培养基中还需加入1 g/L BA.25 ℃、200 rpm振荡培养24 h，菌液12 000 rpm离心15 min，分别收集上清液和沉淀.上清液用于总糖测定(3,5-二硝基水杨酸法)，沉淀用于菌丝干重的测定(烘干法).具体操作步骤及总糖吸收率计算方法参考周佳一等方法[15].

1.5　BA对P.digitatum菌落生长的影响

将100 μL浓度为1.0×106spores/mL的P.digitatum孢子悬浮液均匀涂布在PDA培养基上，培养24 h后，取直径为0.5 cm的菌饼，放置在含15 mL PDA培养基的培养皿中央，处理组培养基中含有1 g/L BA，空白PDA作为对照.25 ℃培养，培养1、2、3、4、5、6 d后测量P.digitatum菌落直径[15].

1.6　BA对P.digitatum侵染柑橘果实的影响

[8] ROLSHAUSEN P E, GUBLER W D. Use of boron for the control of eutypa dieback of grapevines [J]. Plant Disease, 2005, 89: 734-738.

1.7　统计分析

与对照组相比，指状青霉P.digitatum在含有1 g/L BA的PDA培养基上生长缓慢.培养3 d后，对照组培养基上P.digitatum的菌落直径已约为2cm，而此时含有1 g/L BA的PDA培养基上无P.digitatum菌落产生.培养4d后，含有1 g/L BA的PDA培养基上开始有菌落形成，此时对照组的菌落直径进一步增大.培养4 d、5 d、6 d、7 d、8 d后，含有1 g/L BA的PDA培养基上的P.digitatum菌落直径分别为对照组培养基上菌落直径的28%、24%、21%、20%、20%.综合以上结果表明，1g/L BA处理能显著抑制P.digitatum菌落扩展速度(图3).

通过前文的经济性分析，本文针对不同的结果对深圳港水上“巴士”提出不同的发展建议，以解决深圳港水上“巴士”现存问题，为货主、航运公司及港口带来更大的收益.

2　结果与分析

2.1　形态学鉴定结合rDNA-ITS分析确定分离的病原菌为P.digitatum

从柑橘上分离的病原菌经回接实验表明Penicillium digitatum为主要致病真菌，致病性强，针刺接种后发病率达100%(图1A).分生孢子梗无色，顶端有1～2个分支，呈扫帚状(图1C).绿霉病病害从开始发病到全果腐烂只需要6～7 d，发病初期呈淡褐色、圆形、病斑水渍状，病部软化较易压皱.随后病部迅速长出白色霉层(约1～2 d)，并迅速扩大长出白菌丝，病部中央很快长出绿色外缘分生孢子[2](图1B).与P.digitatum形态及绿霉病症状特征基本吻合.在形态学鉴定基础上，对病原菌进行rDNA-ITS区段扩增，得到约584 bp的PCR产物(图1D)，对其进行序列测定(图1E)后进行Megablast同源性分析.结果表明，分离菌株与Penicillium digitatum strain CNU 7003、Penicillium digitatum strain NRRL CNU 7002匹配率均达到了100%.此外，前50个结果均为Penicillium digitatum品系，匹配率均≥98%.于是，确定所分离的病原菌为Penicillium digitatum.

  

A：P.digitatum侵染柑橘症状； B：P.digitatum菌落形态； C：P.digitatum孢子形态； D：ITS通用引物扩增产物； E：目的片段测序结果.图1　P.digitatum的形态特征及rDNA-ITS分子特征Fig.1　The phenotype and rDNA-ITS molecular character of P.digitatum.

2.2　BA对P.digitatum孢子萌发率及芽管伸长的影响

在PDB液体培养基中，BA(最终质量浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 g/L)对指状青霉P.digitatum孢子的萌发有强烈的抑制作用，且这种抑制作用与BA的浓度呈正相关.即随着BA浓度的增加，BA对P.digitatum孢子萌发的抑制作用增强.当BA的浓度为0.2 g/L时，指状青霉P.digitatum孢子萌发已经受到抑制.此外，相同的培养时间下，不同浓度BA处理组的P.digitatum孢子萌发率均低于对照组.培养13 h后，空白组孢子萌发率>85%，此时1g/L BA处理组孢子萌发率<10%.因此，将1g/L作为BA抑制P.digitatum的最低抑菌浓度(MICs)并用于随后的实验中(表1).

 

表1　不同浓度BA对P.digitatum孢子萌发率的影响Tab.1　The effect of BA with different concentrations on P.digitatum spore germination

  

BA浓度/(g/L)孢子萌发率/%5h7h9h11h13h0.02.67±1.25a8.00±2.16a16.67±3.09a35.33±0.94a86.00±0.82a0.21.67±0.47a2.67±0.47b12.33±0.47b28.67±1.25b44.33±3.30b0.42.67±0.94b5.33±0.47c8.33±0.47c16.33±1.70c40.00±1.63b0.81.00±0.82b1.00±0.82d1.67±0.47d3.00±0.82d15.67±1.25c1.00.000.67±0.47e1.33±0.47e1.00±0.82e2.33±0.47d1.20.33±0.47c0.000.67±0.47e0.67±0.47e1.67±0.47d

注：表中的数据是重复试验的平均值±标准偏差，不同的小写字母代表显著性差异P<0.05.

注：误差线代表3次独立生物学重复实验的平均标准偏差.

图2　1 g/L BA对P.digitatum芽管伸长的影响Fig.2　The effect of 1 g/L BA on P.digitatum germ tube length

  

注：误差线代表3次独立生物学重复实验的平均标准偏差.图3　1 g/L BA对P.digitatum菌落扩展的影响Fig.3　The effect of 1 g/L BA on P.digitatum colony expansion

通过显微镜观察发现，随着培养时间的延长，对照组及1 g/L BA处理组的指状青霉P.digitatum孢子均会完成膨大、萌发以及芽管伸长的过程.而在相同培养时间下，1 g/L BA处理的P.digitatum孢子的芽管长度明显小于对照组孢子.在PDB培养基中分别培养11、13、15、17 h后，1 g/L BA处理的P.digitatum孢子芽管长度分别约为对照组的18%、17%、24%、35%.综合以上实验结果，1g/L BA处理能显著抑制指状青霉P.digitatum孢子的芽管伸长速度(图2).

2.3　BA对P.digitatum菌落生长的影响

所有的试验进行3次生物学重复.采用SPSS 16.0统计软件进行试验数据的ANOVA分析，P<0.05时为差异显著.

在学校的角落里，肯定有很多像吴琮一样被误解、被施以偏见、被忽视的人，他们慢慢变得透明，落入孤立无援的境地。夏霖知道自己根本不是什么魔法少女，但也可以随时伸出援手。

2.4　BA抑制P.digitatum菌丝生物量积累并引起P.digitatum糖代谢障碍

Penicillium digitatum分离自自然发病的柑橘(Citrus unshiu)，并于25±2 ℃在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养10 d.向PDA中加入含0.1% (v/v) Tween-80的无菌水，用玻璃棒刮取菌落表面的孢子，于马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基中培养12 h后收集菌丝.利用DNeasy Plant Mini Kit提取其病原菌基因组.利用真菌ITS通用引物(ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; ITS5: 5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')进行PCR扩增.PCR反应体系、反应参数及PCR产物琼脂糖电泳方法参考赖童飞等方法[14].目的片段送至上海英俊生物技术有限公司测序，结果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi中进行同源性分析，确定菌种类别.

 

注：误差线代表3次独立生物学重复实验的平均标准偏差.

图4　1 g/L BA对P.digitatum菌丝量(A)及糖吸收(B)的影响Fig. 4　The effect of 1 g/L BA on P.digitatum mycelia production (A) and absorption of total carbohydrate (B)

2.5　BA对P.digitatum引起的柑橘绿霉病具有明显的防治效果

  

注：误差线代表三次独立生物学重复实验的平均标准偏差.图5　1 g/L BA对柑橘绿霉病病斑直径的影响Fig.5　The effect of 1 g/L BA on lesion diameterof green mould on citrus

培养2 d后，对照组与处理组柑橘均无腐烂现象；培养3 d后，对照组与处理组柑橘接种指状青霉P.digitatum部位开始产生腐烂现象；培养4 d后，对照组与处理组柑橘果实的病斑直径分别约为3 cm和1.6 cm；培养5 d后，对照组柑橘果实的病斑已基本覆盖整个果实表面，此时处理组病斑直径只约为2.7 cm.以上实验结果表明，1 g/L BA处理可以抑制P.digitatum诱发的柑橘绿霉病病斑扩大(图5).

3　讨论

19世纪60年代，硼酸(BA)及其盐已被作为杀菌剂、抗真菌剂用于医药领域.美国国家环境保护局也曾将BA当作控制蟑螂、白蚁、跳蚤和其他害虫的杀虫剂[16].近些年来，BA在果蔬采后病害防治方面的作用受到研究者们的关注.本研究中，我们初步探讨了BA与果蔬采后病原菌Penicillium digitatum发育及致病力的关系.结果表明，1 g/L BA即能显著抑制P. digitatum的孢子萌发及芽管伸长.培养13 h后，空白组P. digitatum孢子的萌发率>85%，并且已有大量菌丝开始生长；而此时1 g/L BA处理组的孢子才开始萌发.培养17 h后，处理组P. digitatum孢子芽管长度才4.8 μm，菌丝形状异常；这与已报道的硼酸或硼酸盐对其他果蔬采后病原真菌的研究结果一致：培养12 h后，空白组Penicillium expansum大量菌丝已形成，而此时0.1%(w/v)硼酸盐处理组P. expansum孢子才开始萌发.培养17 h后，处理组观察到的P. expansum芽管伸长出现异常，菌丝畸形，而此时对照组P. expansum菌丝分支很明显[11].本研究中，我们还发现，1 g/L BA处理能抑制P. digitatum菌丝生物量积累并可能引起其糖代谢障碍.有意思的是，Qin等的研究表明，1%(w/v)硼酸盐处理能导致病原菌Botrytis cinerea 胞质内溶物：可溶性糖的泄露、损失[12]；Lai等研究也发现[17]，0.3%(w/v)BA能显著抑制P. expansum的糖、脂、蛋白质代谢.

硼或BA不仅对多种果蔬采后病原真菌有较好的抑制作用，而且已有研究结果表明，经硼或BA处理后，果实的质量特征并无显著影响. S等[18]研究发现，对苹果果树喷施硼不会对苹果果实硬度、可溶性固形物含量产生负面影响；Arslan等[7]的研究结果也显示，0.2%(w/v)BA不会对苹果果实的质量特征：硬度、总可溶性固形物含量、pH、重量等产生负面影响.本研究中，BA处理后的柑橘果实外观质量同样未受影响.

尽管目前研究者对BA的抑菌机理还不明确，可能是通过引起病原菌细胞内活性氧代谢紊乱，破坏线粒体的功能，导致蛋白质氧化损伤，抑制病原菌细胞外水解酶的分泌[11,19].不可否认，BA是一种成本低、环境友好的化合物，可以被单独或与其他合成杀菌剂结合使用于果蔬采后病害综合防治中.然而，在实际应用中，BA可能引起皮肤刺激，其生物安全性有待进一步的评估；采前采后喷施硼酸对柑橘果实采后贮藏期品质变化的影响有待进一步确证；BA对P.digitatum作用的确切模式有待深入研究.未来的研究中，我们一方面会着眼于进一步挖掘BA的具体抑菌机制，明确其下游作用靶标及作用模式，另一方面则重点优化BA的使用范围和条件，进一步加强果实采后病害专业化统一防治及非化学农药防治技术与产品的研发及推广.希望我们的研究结果能为指状青霉P.digitatum的防治提供一定的理论基础，为其他果蔬病害的防治拓展思路.

参考文献:

[1] LIU Y, WANG W H, ZHOU Y H, et al. Isolation, identification and in vitro screening of Chongqing orangery yeasts for the biocontrol of Penicillium digitatum on citrus fruit[J]. Biological Control, 2017, 110: 18-24.

柑橘(Citrus unshiu)购自浙江杭州市下沙物美超市；硼酸(BA)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR相关试剂购自日本TaKaRa公司；实验所用其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司；实验所用试剂盒：DNeasy Plant Mini Kit及Gel Extraction Kit购自德国QIAGEN公司.

[2] 路来风.海洋拮抗酵母Rhodosporidium paludigenum对柑橘果实抗性的增强效应及其生物学机理研究[D].杭州：浙江大学，2015.

[3] ERASMUS A, LENNOX C L , KORSTEN L, et al. Imazalil resistance in Penicillium digitatum and P. italicum causing citrus postharvest green and blue mould: Impact and options [J]. Postharvest Biology and Technology, 2015, 107: 66-76.

[4] SUN X, WANG J, FENG D, et al. PdCYP51B, a new putative sterol 14α-demethylase gene of Penicillium digitatum involved in resistance to imazalil and other fungicides inhibiting ergosterol synthesis [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 91(4):1107-1119.

[7] ARSLAN U. Efficacy of boric acid, monopotassium phosphate and sodium metabisulfite on the control of apple scab [J]. Journal of Phytopathol, 2016, 164(9): 678-685.

[6] HANAOKA H, URAGUCHI S, TAKANO J, et al. OsNIP3;1, a rice boric acid channel, regulates boron distribution and is essential for growth under boron-deficient conditions [J]. Plant Journal, 2014, 78(5): 890-902.

[5] 冯丹，孙学鹏，姜丽英, 等. 浙江衢州地区柑橘绿霉病菌对抑霉唑和多菌灵的抗性水平及其分子机制[J]. 农药学学报，2011，13(4)：341-346.

选取大小、成熟度一致、无病斑的柑橘果实，自来水冲洗干净后，在70%乙醇溶液中浸泡2 min.用无菌水漂洗10 min，待果实表面自然晾干后，用无菌接种针在果实表面中部固定部位刺2 mm深，1 mm宽的伤口.接种10 μL 1.0×106spores/mL P.digitatum孢子悬浮液(含1 g/L BA的为处理组，不含BA的为对照组)于果实伤口处，每组取6个果实，果实贮藏于95%RH、25 ℃下的无菌塑料袋中.接种后1-5 d，每天定点记录柑橘果实的发病率及病斑直径[15].

[9] MAHMOUD Y A G, EL SOUOD S M A, ALSOKARI S, et al. Recent approaches for controlling brown spot disease of faba bean in Egypt [J]. Egyptian Academic Journal of Biological Sciences, 2011, 3(1): 41-53.

[10] HAFEZ M, HAGGAG H E. Quality improvement and storability of Apple cv. Anna by preharvest applications of boric acid and calcium chloride [J]. Research Journal of Agriculture & Biological Sciences, 2007, 3:176-183.

1052 Effectiveness of neuromuscular electrical stimulation combined with swallowing training for dysphagia after acute ischemic stroke

[11] QIN G Z, TIAN S P, CHAN Z L, et al. Crucial role of antioxidant proteins and hydrolytic enzymes in pathogenicity of Penicillium expansum ：analysis based on proteomics approach[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2007, 6(3): 425-438.

[12] QIN G Z, ZONG Y Y, CHEN Q L, et al, Inhibitory effect of boron against Botrytis cinerea on table grapes and its possible mechanisms of action [J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 138(1/2): 145-150.

其一，“泛化”导致“淡化”。在职业军人的字典里、在打仗和准备打仗的军队里，一切“位子”都归于“战位”，即士兵的战斗岗位和军官的指挥岗（席）位。古今中外，概莫能外。现如今，我军士兵的战斗岗位之“位”泛化程度有限，战斗和战斗准备的内核趋于完整。然而，指挥岗位之“位”的概念，则不断游离于本质内涵，且杂义丛生，义项在不断泛化。如领导岗位、工作岗位、谋生职位，甚至社会地位、经济地位等。草盛稻菽萎，泥多水难清。当指挥岗（席）位的附着物、衍生物越来越多时，其谋战领战的内核就越来越销迹于形形色色的杂义曲解之中，甚至被其他高频使用的杂义乱项所淹没或淘汰。

近日，《广州综合交通枢纽总体规划(2018—2035年)》通过市政府常务会议审议，为广州建设国际性综合交通枢纽制定了“路线图”。具体细节规划和研究已经开始，11月15日，广州市轨道交通一体化规划研究及广州东站综合交通枢纽规划项目开始招标。

[13] THOMIDIS T, EXADAKTYLOU E. Effect of boron on the development of brown rot (Monilinia laxa) on peaches [J]. Crop Protection, 2010, 29(6): 572-576.

[14] 赖童飞，刘毅，任梦，等. 外源一氧化氮对果蔬采后病害Penicillium expansum发育的影响[J]. 农业生物技术学报，2013，21(3)：253-262.

[15] 周佳一，刘雅红，王娅妮，等. 硼酸、肉桂油及亚磷酸钾对采后病原菌Fusarium oxysporum生长发育的影响[J]. 杭州师范大学学报(自然科学版)，2016，15(2)：149-155.

[16] QUARLES W. Boric acid, borates and household pests [J]. The IPM practitioner，2001，23: 1-12.

[17] LAI T F, WANG Y, BAI X L. Dissecting inhibitory effect of boric acid on virulence and patulin production of Penicillium expansum [J]. Postharvest Biology and Technology, 2016, 117: 187-196.

基于应用的《体育统计学》教学模式，不能简单地理解为“将统计学方法应用于实际问题”，而应该理解为“从应用的视角”去解读“统计方法”，进而理解统计方法的确切涵义，从而达到培养学生定量思维的目的。

[18] S A A D， ERNANI P R， NAVA G, et al. Forms of boron application and its influence on quality and yield of apples (Malus domestica) [J]. Revista Brasileira De Fruticultura, 2014, 36(2): 487-494.

[19] SHI X Q, LI B Q, QIN G Z, et al. Mechanism of antifungal action of borate against Colletotrichum gloeosporioides related to mitochondrial degradation in spores [J]. Postharvest Biology and Technology, 2012, 67: 138-143.

保持体形，是咱们女人一生的事业。刚生完孩子根本不敢上秤，不想被贴上油腻妇女的标签，就要“管住嘴，迈开腿”。