大约70%的人类疾病基因，在结构和功能上与斑马鱼高度相似[1]，因此斑马鱼作为模式动物的一种，广泛应用于脊椎动物的基因表达和调控研究以及人类疾病、遗传学和生长发育的研究。斑马鱼的发育非常迅速，胚胎透明，易于显微操作和观察，另外斑马鱼荧光染色、组织移植技术、全胚组织标本制作及全胚原位杂交技术均已成熟[2]。斑马鱼所具有的独特优势让其成为研究脊柱动物形态发生、神经发育、药物筛选和环境检测等领域的重要模型之一.

之前已有研究表明，斑马鱼的lmo4基因与哺乳动物的原癌基因lmo4为直系同源基因[3]，该基因动态表达于斑马鱼的前脑和视觉原基细胞，在神经细胞多样性的发生、促进神经管闭合以及乳腺管组织增生等过程中有重要功能[4-7].Lane等[3,8]的研究表明，斑马鱼的lmo4基因有两个同源基因即lmo4a和lmo4b.lmo4a与哺乳动物lmo4基因有更强的同源性，lmo4b基因除与lmo4a及其他哺乳动物lmo4基因之间高度保守外，在特定位置有独特冗余，提示该基因有潜在的新功能.Lane等[8]通过Morphlino诱导的lmo4b抑制，发现该基因对于斑马鱼的前脑和视觉囊泡发育有扩大作用，在直接稳定原肠胚后期的前端神经组织边界以及限制前脑和眼睛的大小方面有重要作用.为进一步研究lmo4b基因对于斑马鱼大脑其他区域是否有相同的作用，以及这种作用会不会导致神经细胞，例如多巴胺神经细胞的数量变化，我们开展了lmo4b对斑马鱼脑部大小发育和内耳形态学的影响研究.

本文通过对EGFP标记多巴胺神经细胞的斑马鱼受精卵显微注射人工合成的lmo4b Morphlino，运用激光共聚焦成像技术研究斑马鱼发育过程中形态发生的表型，以期进一步研究lmo4b抑制对斑马鱼脑部及内耳形态发育的影响，丰富其调控机制内容，为探索该基因在哺乳动物发育中的功能调控奠定基础.

过程与方法目标如下：（1）在查阅资料的过程中，培养学生探索“四新”的能力和自主学习的能力。（2）在小组合作的过程中，培养学生善于思考、善于发现的思维能力，培养与他人协作的工作能力。（3）在检测电阻归类总结的过程中，发展学生综合职业能力。

1　材料与方法

1.1　实验材料及试剂

实验所用斑马鱼成体均为脑部EGFP标记多巴胺神经细胞的转基因品种(Tg(Dat:EGFP)).斑马鱼成体均统一生活在温度范围为27-29 ℃，pH范围为6.0-7.5的人工控制水循环系统中.实验所用斑马鱼胚胎则是通过成体斑马鱼的自然交配获得.出生当天记为0天，出生后1小时为1 hpf，出生后1天为1 dpf，以此类推.

3) 使用Parker Picospritzer III型微量注射仪对处于1-2cell时期的受精卵以酚红为定量指示进行注射；

6) 成像结果利用Photoshop CS3软件中的长度测量功能以像素为单位进行测量获得相关数据并分析.

2) 50X PTU培养液(抑制色素)：0.1524 g PTU ddH2O定容至100 mL(用E3培养液稀释至1X使用).

1.1.2　共聚焦显微镜成像试剂

1) 0.02% MS222麻醉液(100 mL)：0.02 g MS222，dH2O(millipore-Q-integral-5)定容至100 mL；

2) 1%低熔点胶(100 mL)：1 g 低熔点琼脂糖，50 mL 0.02% MS222，dH2O定容至100 mL.

传统数字出版服务商普遍提供框式检索、高级检索、专业检索等服务，可以按资源结构化力度（按章节、观点、知识元、药物、书等）提供检索，也提供全部检索。

1.2　实验方法

1.2.1　收集鱼卵用于显微注射

产卵条件为温度29℃，pH7.0-7.5，挑选成年斑马鱼以雌雄比例为1∶1或1∶2黑暗分隔8 h以上后以光照刺激促其产卵交配；所产的新卵经漏斗收集后于培养皿中以E3培养液进行培养.

1.2.2　显微注射lmo4b MO干扰胚胎发育

本研究采用lane[8]发表的lmo4b MO设计，序列为5’-CTGTTCACCATCGCCTGCCGT-TATT-3’，对照序列为5’-CTGaTCAgCATCGCCTGCgGTTtTT-3′(小写字母为错配核苷酸).在细胞内该分子将与lmo4b基因的mRNA特异结合，在翻译起始前来阻断该mRNA的翻译，使lmo4b基因在表达水平上被阻断，继而达到抑制基因的目的，此MO的抑制效果已经在lane研究中被验证.

实验中采用Parker Picospritzer III型显微注射仪对斑马鱼受精卵进行人工合成的lmo4b MO的注射操作，从而干扰受精卵的后期发育产生相应的表形.酚红在显微注射中通过与适当浓度lmo4b MO混合，从而作为一种注射指示剂对胚胎所注射外源物质进行定量.

1) 斑马鱼交配并收集新产的斑马鱼受精卵；

“三年前我大学毕业想证明自己，就在外面租了房子，和夏薇合租的。”范青青拿眼瞟田铭，田铭蹙眉，她和夏薇在一起一年，他连这个都不知道，“我在夏薇那儿听说过你很多的事，也见过你，在那个正月十五前你在步行街卖灯笼。”范青青试探性看他。

2) 准备lmo4b MO用Nuclearfree Water稀释到相应浓度，与等量的酚红混合并加入到毛细注射针头中；

1.1.1　斑马鱼培养试剂

4) 注射后的胚胎(MO)及其同亲本野生型对照组加入适量E3培养液于28 ℃培养箱中恒温培养；

5) 注射后培养8 h后对未含酚红、发育畸形及已经死亡的胚胎进行剔除，保留发育正常及含有酚红的胚胎；

显微注射后，lmo4b MO将对受精卵的早期胚胎发育产生一定的干扰作用，这将在胚胎表型上有一定的表现.通过测量注射lmo4b MO后发育3d阶段斑马鱼的前脑、间脑的宽度及内耳的长度并与未注射的野生型测量数据进行比较，在数量及形态上估计lmo4b对斑马鱼脑部大小及内耳的影响，对应两组胚胎的测量数目均大于6.测量结果通过计算其平均值、T检验和置信区间来判断有无显著差异.

1.2.3　胚胎形态测量与统计

6) 注射后培养13 h，将原E3培养液置换成1X PTU培养液以抑制色素形成.

1) 配制1%低熔点胶于37 ℃水浴锅保温；

本系统由个人健康档案、疾病风险预警、健康干预、健康宣教、用药管理、系统管理五个部分组成。个人健康档案模块主要功能包括患者基本信息、历史体检信息、日常监测信息、随访记录。预警管理模块主要功能包括自定义预警值、预警信息推送、历史监测结果与预警值对比图、预警记录查询。健康评估模块主要功能包括疾病风险评估报告、健康促进报告。用药管理模块主要功能包括用药计划设置和管理、用药提醒、用药后签到、用药历史查询。健康宣教模块主要功能包括多媒体健康信息推送、健康互动小游戏、带学习功能的调查问卷。系统管理模块主要功能包括医生账户管理、患者账户管理、疾病类别管理、疾病级别管理。

2) 取注射后发育3 d已孵化的斑马鱼胚胎于0.02% MS222麻醉液中进行麻醉；

3) 吸取已麻醉的斑马鱼胚胎于培养皿中，吸除多余溶液，滴加低熔点胶将胚胎覆盖；

4) 于Nikon SMZ1500体式显微镜下调整斑马鱼姿态，使其侧向平置，眼与耳部朝上；

（112）中华裂萼苔 Chiloscyphus sinensis J.J.Engel et R.M.Schust.范苗等（2017）

[3] LANE M E, RUNKO A P , ROY N M , et al. Dynamic expression and regulation by Fgf8 and Pou2 of the zebrafish LIM-only gene,lmo4[J]. Mech Dev, 2002，119 (3/4)：S185-189.

1) 60X E3培养液(1 L容量)：17.2 g NaCl，0.76 g KCl，2.91 g CaCl2∶2H2O，4.9 g MgSO4∶7H2O，dH2O(millipore-Q-integral-5)定容至1 L(用dH2O稀释至1X使用).

4.1 近50来，该地区年降水量略有增加，东北部降水量大于西南部。从东北部到西南部年降水量变异系数逐渐增大，降水稳定性变差。降水量的增加主要集中在冬、夏季，春、秋两季降水量总体呈下降趋势。

1.2.4　激光共聚焦(Confocal)显微镜成像

正因为这种不注重物质，甚至有点“不近人情”的朴素生活，才让居里夫人专心致志地投入到科研工作，将全部时间，甚至生命用于热爱的事业与梦想上。她为人类谋取到巨大幸福——发现化学元素钋和镭，指导人们第一次借助放射性同位素治疗癌症。

1) 配制1%低熔点胶于37 ℃水浴锅保温；

2) 取注射后发育3 d已孵化的斑马鱼胚胎于0.02% MS222麻醉液中进行麻醉；

通过对互联网资料、研究报告和相关案例的整理和分析，可以将现有政府引导基金扶持新兴产业发展的主要模式总结如下：

统计2015～2017年国家药品不良反应监测中心反馈的药品不良反应/事件报告表795份，分析患者人口学特征、原患疾病、不良反应/事件等。

4) 于Nikon SMZ1500体式显微镜下调整斑马鱼姿态，使其脑部贴合皿底；

3) 吸取已麻醉的斑马鱼胚胎于共聚焦皿中，吸除多余溶液，滴加低熔点胶将胚胎覆盖；

5) 待固定胶凝固后于ZEISS LSM710共聚焦显微镜下进行脑部多巴胺神经细胞荧光三维成像.

多巴胺神经细胞的三维荧光图像分析通过Carl Zeiss ZEN 2012图像处理软件进行三维图像的拼叠合成，再利用Photoshop CS3软件中的计数功能进行人工多巴胺神经细胞计数统计，数据统计结果通过统计数据的平均值、T检验及置信区间来判断两者间是否存在显著差异.

2　结果与分析

2.1　lmo4b转录抑制后使斑马鱼脑部增大，但与多巴胺神经细胞的数量无显著相关

2.1.1　激光共聚焦显微镜对多巴胺神经细胞成像计数结果

  

注：箭标所示方框为前脑结构，箭头所指方框为间脑结构图 1　Tg(Dat:EGFP)斑马鱼脑部Confocal成像2D投射图Fig.1　2D projection of Confocal imaging of Tg(Dat:EGFP)zebrafish brain

Lane等[8]人的研究结果表明，斑马鱼发育过程中lmo4b会通过对Six3等相关决定脑部神经细胞发育与增殖基因的负调控而限制斑马鱼大脑的发育.在此基础上，我们利用EGFP转多巴胺神经细胞的斑马鱼进一步研究，以观察lmo4b是否是通过对多巴胺神经细胞的调控而限制斑马鱼脑部大小或者lmo4b对斑马鱼脑部的负调控作用是否会对多巴胺神经细胞产生影响.我们对处于1-2个细胞时期的斑马鱼受精卵进行了lmo4b特异的MO注射，恒温培养至6 dpf时对其脑部多巴胺神经细胞进行Confocal成像，成像结果见图 1.

统计6 dpf时期多巴胺神经细胞数量后发现注射MO的斑马鱼胚胎脑部多巴胺神经细胞数量与野生型并无显著差异，见图2.

考虑到Morphlino的效率问题，并且为进一步验证lmo4b在斑马鱼胚胎发育过程中对其脑部的调控作用，随后我们在胚胎注射后的3 dpf重复一次实验，再次进行Confocal成像，统计结果表明3 dpf时期的前脑与间脑多巴胺神经细胞数量均无显著差异.

2.2 E组眩晕发生率显著高于A、B、C、D组 (P＜0.01)，C 组眩晕发生率显著高于 A、B、D 组(P＜0.01)，见表2。

  

A：Confocol 2D投射图； B：数量统计(t-test)，p>0.05.图2　6dpf WT和MO的前脑和间脑的多巴胺神经细胞Fig.2　DA neurons number analysis of 6dpf MO and WT

2.1.2　激光共聚焦显微镜成像结果脑部宽度测量比例统计结果

与此同时，我们利用拍摄的斑马鱼脑部多巴胺神经细胞Confocal图像，对注射后发育3 dpf及6 dpf的MO及野生型(WT)的前脑及间脑宽度进行测量，测量前脑及间脑两端间距最大的多巴胺神经细胞间距，作为相应脑区的宽度大小.统计后发现3 dpf的MO前脑及间脑宽度相对于野生型并无显著差异(P=0.0981、0.3294)；对处于6 dpf的幼鱼经统计后发现间脑的宽度相比野生型，有显著差异(P=0.030454 )；对于前脑而言，结果显示MO的前脑显著增大，MO与WT间存在极显著差异(P=0.000010)，见图3.

  

A：测量示意图； B：数据比较(t-test)***，P<0.001; *, P<0.05图3　6 dpf WT和MO前脑和间脑多巴胺神经细胞最宽距离比较Fig.3　Comparison of the widest distance of DA neurons in the forebrain and diencephalon of 6dpf WT and MO

2.2　lmo4b抑制后对斑马鱼内耳影响的形态学观测及统计结果

斑马鱼受精卵注射lmo4b MO 后，在胚胎发育过程中内耳发生了一些形态学上变化.在6 dpf时期对MO与对应的WT组斑马鱼胚胎的内耳分别进行拍摄记录，结果显示，MO组内耳的椭圆囊和豆状囊两个结构的间距较WT组更近，且部分MO内耳的两个次级结构完全重合，出现一些内耳发育的畸形(图4A).

与此同时，对两组内耳进行了长度上的测量及统计，结果显示两组胚胎的内耳长度比例存在显著差异(P=0.026135)，统计结果见图4B.

  

A:形态变化比较； B:长度比例测量(t-test)，*, P<0.05.图4　6 dpf斑马鱼 MO与WT内耳变化比较 Fig.4　Morphological changes of inner ear between 6 dpf MO and WT

3　讨论

斑马鱼的lmo4基因有两个同源基因即lmo4a和lmo4b.高儒真[2]研究了lmo4a基因在斑马鱼内耳发育中的功能，结果表明lmo4a经Morphlino抑制后使斑马鱼内耳耳泡大小、毛细胞数目、听平衡神经节内细胞数目呈等比减少，致内耳半规管发育畸形，显示了该基因在斑马鱼内耳发育的重要调节作用.在小鼠耳泡中组织特异性敲除lmo4可见内耳半规管发育异常、前后半规管嵴发育不良[9-10]，但高儒真[2]利用Morphlino抑制lmo4b的表达后，观察到斑马鱼的内耳发育未受到显著影响.Lane等[3,8]对lmo4b的研究表明，在斑马鱼发育早期lmo4b通过限制相关基因的表达而对其前脑及眼的分化和发育起着负调控作用；lmo4b经Morphlino抑制后由于相关调控基因的过表达会导致其胚胎前脑及眼睛囊泡发育增大；而经lmo4b mRNA注射过表达由于相关调控基因被抑制则会出现相反的表型，包括脑部神经细胞的减少，眼睛、下丘脑等器官发育的变小.因而，lmo4b在斑马鱼早期神经系统发育中通过调节相关基因而间接的对主要器官细胞的命运、细胞增殖及细胞生长是必要的.

本研究通过对转基因斑马鱼(Tg(Dat:EGFP))进行胚胎显微注射lmo4b Morphlino，抑制lmo4b基因表达，结果表明该基因的调控作用与多巴胺神经细胞的数量没有显著的相关性，验证了Lane等[8]人提出的斑马鱼lmo4b基因抑制对其胚胎前脑发育的扩大作用；同时我们发现该基因抑制对斑马鱼间脑体积的发育有减小作用.此外，值得注意的是，研究结果显示lmo4b基因抑制使斑马鱼内耳的椭圆囊和豆状囊两个独立有间距的次级结构发生重叠，对内耳发育致畸作用非常明显.

在后续研究中我们将开展lmo4b的过表达实验，对不同时期的斑马鱼胚胎进行过表达实验观察；为完善实验设计，将在原来实验的基础上进行lmo4b抑制后注射lmo4b RNA以抵消lmo4b抑制效应的拯救实验.通过研究进一步拓展lmo4b基因在斑马鱼发育过程中的功能调控机制，为进一步探索该基因在哺乳动物发育中对脑[11]、眼睛[12]、内耳[13]等重要器官形成的调控机制，以期为相关疾病的功能研究提供思路和奠定理论基础.

参考文献:

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[2] 高儒真. lmo4a基因在斑马鱼内耳发育中的功能研究[D].北京：北京协和医学院，2012.

5) 待固定胶凝固后使用Nikon SMZ1500 体式显微镜及其Digital Sight DS-U3数码照相机进行成像拍摄；

[4] VISVADER J E, VENTER D, HAHM K, et al. The LIM domain gene LMO4 inhibits differentiation of mammary epithelial cells in vitro and is overexpressed in breast cancer[J]. P Natl Acad Sci USA, 2001, 98(25):14452-14457.

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3. Mr. Shakabpa and other members of the said mission have no authority to enter into direct relations with the United States government, but the Chinese Embassy will be glad to facilitate the purpose of their visit, which is understood to be in the interest of trade.

[7] LEE S K, JURATA L W, NOWAK R, et al. The LIM domain-only protein LMO4 is required for neural tube closure[J]. Mol Cell Neurosci, 2005, 28(2): 205-214.

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(1) 针对柴储混合电力系统,提出了柴油发电机和储能系统间的负荷频率协调控制,通过将调频信号精细化处理为高低频分量,由柴油发电机和储能系统分别承担低频分量和高频分量,以实现不同发电装置对频率管理的协调控制,提高了发电装置的利用率。

[9] CHEN W, BURGESS S, GOLLING G, et al. High-throughput selection of retrovirus producer cell lines leads to markedly improved efficiency of germ line-transmissible insertions in zebra fish[J].J Virol, 2002,76(5):2192-2198.

近年来，国企频繁进行改革改制、重组、收购等操作，对应企业的管理模式、经营体系、产权结构等也随之发生改变。国企充分落实深化改革要求的较少，但是进行结构调整、规模扩张的趋势较为突出。企业审计团队的规模逐渐朝着稳定化方向发展，审计对象缩小，但是审计内容大幅扩张，增加了相关作业人员的工作量；同时深化改革下，逐步突破了地域界限、行业界限，导致审计监督工作的难度大幅增加；此外，改革后，一些企业的收入、负债等存在较大偏差，降低了同期数据的可参考价值，受会计评估等政策的改变，深化改革下审计难度大幅增长。

[10] HIGGS D M, ROLLO A K, SOUZA M J, et al. Development of form and function in peripheral auditory structures of the zebrafish (Danio rerio) [J].J Acoust Soc Am, 2003, 113(2):1145-1154.

[11] KENNY D A, JURATA L W, SAGA Y, et al.Identification and characterization of LMO4, an LMO gene with a novel pattern of expression during embryogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998, 95(19):11257-11262.

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