牡丹(Paeonia suffruticosa)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)的多年生落叶小灌木，花色艳丽，素有“花中之王”的美誉.菏泽是全国牡丹栽培面积最大，品种最多的牡丹集中栽培区.经过长期引种、选择和反复杂交等导致品种来源复杂，牡丹种质形成了丰富的遗传变异.牡丹品种间形态特征主要表现为：九大花色、十六种花型，六类叶型，四类花蕾型[1～2].虽然牡丹各品种之间在形态上有一定差异，但也存在很多共同的特征，使得品种间的遗传关系变得模糊不清.近几年来，采用分子标记技术在牡丹品种间亲缘演化关系上的研究开展较多，揭示了栽培牡丹品种之间的遗传关系，对牡丹种质资源的利用和品种改良奠定了基础[3～4].

叶表皮结构特征具有一定的遗传稳定性，其微形态特征在一定程度上可以反映植物类群间的亲缘关系，在植物种间、种内或属间分类具有重要的研究意义[5～6].气孔是植物体与外界进行气体和水分交换的蒸腾的主要器官[7～8]，许多学者研究指明，叶表皮气孔特征是植物种质资源多样性研究中一重要指标，在植物遗传变异和分类学上有着较重要的应用价值[9] .但针对牡丹叶表皮微形态特征的研究还未见报道.本文通过对8个品种的牡丹进行了叶表皮形态微特征观察比较，来探索其在牡丹种质资源研究中的作用，为牡丹品种的鉴定和分类提供理论依据.

1 材料与方法

1.1试验材料

本研究所用材料来自菏泽百花园.采集时间为牡丹花期过后的上午9点.牡丹种质材料见表1 .

 

表1 牡丹种质材料

  

品种花型花色花期叶形绿幕隐玉绣球型初浅绿色,盛时白色花期晚大型长叶花二乔蔷薇型复色,紫红和粉红色花期中中型圆叶赛雪塔皇冠型白色略带淡桔黄色花期中大型长叶乌龙捧盛千层台阁型紫红色花期中中型长叶紫二乔蔷薇型、菊花型紫红和粉色,墨紫斑花期中中型长叶魏紫皇冠型紫色花期晚小型长叶银粉金鳞皇冠型粉红色花期晚中型长叶朱砂垒荷花型浅红色微带紫花期中大型圆叶

1.2 研究方法

将采集的牡丹叶片用蒸馏水清洗干净，用吸水纸吸干水分.用印痕法[10]制取叶下表皮，撕取固定好的印液，置于载玻片上，盖上盖玻片制成临时装片.

1.2.1 叶表皮显微观察及表皮细胞数

1)旱坡地面源污染物生态工程拦截技术研究。众所周知，三峡库区旱坡地较多，由于垦殖过度、复种指数高与耕作管理粗放，使其成为该区养分流失和水土流失的主要发生地以及江河泥沙的主要来源[5]。因此，从旱坡地降水的就地拦蓄，实现降水资源化的生态工程研究着手，并以建设3大水库(土壤水库、生物水库和工程水库)为基础，利用条带植物篱、保护性耕作、高分子调控剂等构建旱坡地生态工程拦截体系，同时采用旱地作物专用缓/控释复合肥料产品、清洁生产施肥技术体系，进行旱坡地水肥耦合高效利用技术研究。

1.2.2 气孔形态大小比较

在10×40倍光学显微镜下观看装片，随即观测并统计材料近中部的表皮细胞数目，分别测量表皮细胞垂周壁长度(每视野测定3个气孔器周围的表皮细胞).每装片观测10个不同视野，每个样品重复3次，求其平均值.

式中:vx、vy、vz是子弹速度在地面坐标系上的分量;x、y、z是子弹质心坐标;ρ是空气密度;Sx、Sy、Sz是子弹在三个方向的迎风截面积;Cx、Cy、Cz是阻力系数;m是子弹质量;g是重力加速度;t是时间。

随机选10个视野，统计气孔数，并选择关闭状态下的气孔(20个)测量气孔的长轴、短轴.每个样品重复3次.

1.2.3 气孔密度

按照公式I (%)=[D/(D+P)]×100%计算气孔指数.其中D代表气孔数，P代表表皮细胞数.

1.2.4 气孔面积计算

8个牡丹品种的气孔器为不规则型，保卫细胞皆为肾形，气孔器形状为椭圆形(见图1).经数据处理得到牡丹叶下气孔器数目及气孔大小，见表3.

按照公式计算气孔面积.其中a代表气孔器的长轴，b代表气孔器的短轴.

专项整治后我院住院患者抗菌药物使用量与大肠埃希菌耐药率的变化及其相关性分析 ………………… 奚彩萍等（2）：204

1.2.5 气孔指数(I)

在叶片中部尽量远离叶脉的区域随机观测统计10个视野的气孔数并求出其平均值.每个样品重复3次.

利用数码显微镜摄像系统(Olympus BX53)观察拍照，图像处理系统采用Cellsens Standard软件测量，分别用Excel 和SAS软件进行数据处理和方差分析.

1.2.6 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同品种叶下表皮细胞形状大小、垂周壁和气孔形态

利用数码显微镜摄像系统观察拍照，得到8种牡丹叶下表皮特征，如图1所示.

  

A：绿幕隐玉 B：花二乔 C：赛雪塔 D：乌龙捧盛 E：紫二乔 F：魏紫 G：银粉金鳞 H：朱砂垒图1 不同品种牡丹叶下表皮特征(10×40)

由图1可见，不同品种牡丹叶表皮细胞均为不规则形，垂周壁式样为波浪型，波纹深浅不一，其中魏紫(F)为浅波状，朱砂垒为深波状，其余为波状类型.

经数据处理后，得到不同品种牡丹叶下表皮细胞数和垂周壁长度，见表2.

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在本科生教学过程中实行导师责任制，不仅发挥了导师在临床医学教学过程中全方位的引导作用，提高了导师的教学效率，同时也体现了学生在教育、教学过程中的主体地位，促进其学习的高效与主动[7]。导师的指导与督促在医学生进入临床的初学阶段至关重要，在导师的指导下，医学生能积极主动地学习，独立思考，勇于探索，培养临床逻辑思维，不仅能强化对理论知识的理解和梳理，更能够使他们学会如何在临床中应用这些知识[2，8-9]。

 

表2 不同品种牡丹叶下表皮细胞数和垂周壁长度比较

  

品种表皮细胞数目(个/mm2)垂周壁长度(um)绿幕隐玉475±30bc54.67±0.94bc花二乔432±61cd45.00±0.82d赛雪塔535±51ab51.67±5.25cd乌龙捧盛 517±136ab55.00±5.35bc紫二乔395±39d59.00±0.82b魏紫556±106a35.67±1.70e银粉金鳞409±39cd54.67±6.02bc朱砂垒319±36e73.00±0.82a

注：表中同列比较数据后小写英文字母表示差异显著(P﹤0.05).下同.

由表2可知，8个品种牡丹叶下表皮细胞的数目在319～556个/mm2之间，其中朱砂垒和紫二乔两品种的表皮细胞数目较少分别为319和395个/mm2，而魏紫的叶下表皮细胞数目最多为556个/mm2. 垂周壁的长度范围在35.67～73.00 um之间.

2.2 不同品种牡丹叶下气孔器形态及气孔大小比较

冯一余捏着人家的车钥匙，人困得眼睛都睁不开了，心里一毛躁，也不想多说话了，打开那辆车的车门，就坐上去，说，我不管，我先把你的车倒出去，把我的车位腾出来。那女的尖声叫起来，你下来，你下来，你腾出来了，我们的车怎么办？我到哪里找那个人去？冯一余说，人家占了你的车位，又没有占我的车位，凭什么我的车位要让给你？

 

表3 不同品种牡丹叶下气孔器数目及气孔大小比较

  

品种气孔器数目(个)气孔长轴(um)气孔短轴(um)气孔长/短轴比绿幕隐玉14±2bc24.36±0.79c7.68±0.74f3.69±0.19a花二乔14±3bc27.59±0.58ab9.79±0.63bcd2.93±0.14bc赛雪塔12±4cde22.83±1.18cd8.46±0.78ef2.75±0.37cd乌龙捧盛14±2bc23.04±0.64cd8.31±0.66ef3.21±0.06b紫二乔11±2de28.17±0.39a10.16±0.16bcd2.82±0.13cd魏紫21±3a22.44±0.98d9.43±0.83cde2.51±0.19de银粉金鳞14±3bcd26.48±0.48b10.32±0.58bc2.72±0.08cd朱砂垒10±2e28.70±0.72a10.81±0.47ab2.82±0.1cd

由表3 可以看出，8个牡丹品种中朱砂垒的气孔数目最少，为10个，其次是紫二乔为11个，而魏紫的气孔数目最多，为21个.气孔长轴最大的是朱砂垒，为28.7 um，最小是魏紫，为22.44 um.气孔短轴最大是朱砂垒，为10.81 um，最小是绿幕隐玉，为7.68 um.气孔长/短轴之比最大的是绿幕隐玉，为3.69，最小是魏紫，为2.51.

2.3 不同品种牡丹叶下表皮气孔特征比较

经数据处理得到8种牡丹牡丹叶下气孔的气孔指数、气孔面积和气孔密度，见表4.

 

表4 不同品种牡丹叶下气孔特征比较

  

品种气孔指数(%)气孔面积(mm2)气孔密度(个/mm2)绿幕隐玉18.91±2.57bc803.00±35.4de111.11±18bc花二乔20.09±8.34abc984.33±63.5a109.06±96bc赛雪塔14.13±3.77d828.67±86.6dc88.58±27cde乌龙捧盛17.53±1.33c715.33±41.7ef109.83±18bc紫二乔17.52±2.92c902.67±50abcd84.77±18de魏紫22.32±5.84a670.33±43f159.50±23a银粉金鳞20.82±2.93ab871.67±40.5bcd107.27±19bcd朱砂垒18.57±2.61bc936.67±62.3abc73.22±16e

由表4看出.8个品种牡丹叶下气孔指数、气孔面积和气孔密度的差异较大.气孔指数最大的是魏紫，为22.32%，最小的是赛雪塔，为14.13%，其余的在17～21%之间.气孔面积最大的是花二乔，为984.33 mm2，最小的是魏紫，为670.33 mm2.气孔密度最大的是魏紫，为159.50个/mm2，最小的是朱砂垒，为73.22个/mm2.由以上三个特征比较说明了在牡丹培育过程中，经长期的引种和杂交使牡丹各品种之间形成了气孔特征的遗传多样性.

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2.4 不同品种牡丹叶表皮微形态特征指标的变异系数比较

经数据处理得到牡丹叶表皮微特征指标变异系数，见表5.

 

表5 不同品种牡丹叶表皮微特征指标变异系数比较

  

品 种表皮细胞数变异系数(%)垂周壁长度变异系数(%)气孔数目变异系数(%)气孔长轴变异系数(%)气孔短轴变异系数(%)绿幕隐玉6.281.7216.533.242.48花二乔14.071.8224.372.101.43赛雪塔9.5310.1630.435.174.37乌龙捧盛26.289.7315.962.780.72紫二乔9.941.3921.770.141.28魏紫19.114.7714.434.372.01银粉金鳞9.5911.0118.161.810.78朱砂垒11.221.1221.622.510.92变异系数平均值13.255.2220.412.761.75

由表5 可知，从几个指标变异系数平均值上看，气孔数目变异系数﹥表皮细胞变异系数﹥垂周壁变异系数﹥气孔长轴变异系数﹥气孔短轴变异系数.由此说明气孔数目的变异程度大于气孔长轴、短轴的变异程度.从气孔数目变异系数看，赛雪塔的变异系数最大，为30.43%，魏紫的最小，为14.43%.

3 讨论

叶表皮细胞特征在植物系统分类学上具有一定的鉴定价值和分类学意义，此外可以提示类群间的演化关系[5，11].本文对8个牡丹品种的叶下表皮微形态进行了比较研究，结果显示：8个品种的叶下表皮细胞形态为无规则型，气孔器呈椭圆型，保卫细胞为肾形，说明各品种之间在叶微形态特征上具有一致性，都归属于芍药科.在表皮细胞数目上朱砂垒最少为319个/mm2，魏紫最多为556个/mm2.垂周壁式样上来说，魏紫为浅波状，朱砂垒为深波状.此二个牡丹品种差别较大，这与王燕青[12]利用SRAP分子标记构建的指纹图谱结果是相一致的，图谱结果显示二者分别属于不同的二个组且遗传距离为68%.

分坛主太极虎任意行、副分坛主鬼算盘钱通、少林天问大师、武当紫阳道长和六位灰衣杀手，他们成两排在聚义堂门前站定。

气孔是气体出入植物体的门户，其构造和生理功能比较一致[13]，但也会存在一些差异.本文研究表明，8个牡丹品种中朱砂垒的气孔数目最少为10个，魏紫的气孔数目最多，为21个.气孔长轴和短轴长度最大都是朱砂垒，气孔长轴最小的是魏紫，短轴最小的则是绿幕隐玉.气孔密度最大的是魏紫，为159.50个/mm2，最小的是朱砂垒，为73.22个/mm2.气孔面积最大的是花二乔，最小的是魏紫.从气孔指数比较结果看，绿幕隐玉与朱砂垒差异不显著，这也与SRAP分子标记分析的指纹图谱结果相一致，二者的遗传距离为79%.银粉金鳞与花二乔的气孔指数也是差异不显著，二者的遗传距离为73%，在同一组.从气孔各指标变异系数上看气孔长轴和短轴的变异系数小，这也说明气孔的形态大小在牡丹品种的稳定性较好.气孔数目变异系数最大，说明牡丹各品种间在气孔数目上存在较大差异.对牡丹品种开展叶表皮微形态特征研究在探讨牡丹品种之间的遗传关系有一定的意义，同时也是对其分子标记研究的补充.此外，气孔的数量和大小与植物的抗逆性有直接的关系[7]，因此，探讨牡丹叶表皮微形态特征为牡丹不同品种之间抗逆性评价提供思路.本研究所用牡丹品种材料相对较少，要筛选出有效的叶表皮指标还要对其它不同品种的牡丹做进一步的分析验证.

参考文献：

[1]王莲英.中国牡丹品种图志[M].北京:中国林业出版社,1997,2-9,20-24.

[2]成仿云,陈德忠.紫斑牡丹新品种选育及牡丹品种分类研究[J].北京林业大学学报,1998, 20(2):27-32.

[3]赵宣,周志钦,林启冰等.芍药属牡丹组(Paeonia sect．Moumn)种间关系的分子证据:GPAT 基因的 PCR-RFLP 和序列分析[J].植物分类学报,2004,42(3):236-244.

[4]陈向明,郑国生,孟丽.不同花色牡丹品种亲缘关系的 RAPD-PCR 分析[J]．中国农业科学，2002,35(5):546-547.

[5]刘艳蕾，郭国业.月季品种的表皮形态多样性研究[J].南阳师范学院学报，2017,16(12):31-35.

[6]ADEBOWALE A,NAIDOO Y,LAMB J,NICHOLAS A. Comparative foliar epidermal micromorphology of Southern African Strychnos L.(Loganiaceae):Taxonomic,ecological and cytological considerations[J].Plant Systematics and Evolution，2014,300(1):127-138．

[7]齐向英,齐龙,赵鹏飞.12个枣树品种叶片气孔性状研究[J].江苏农业科学,2009,3:199-200.

[8]李波,于海龙.12 种苜蓿叶片表面微形态结构的比较[J]. 电子显微学报,2016, 35 (2):156-161.

[9]曾妮,张建茹,常朝阳.中国蔷薇属植物叶表皮微形态特征及其系统学意义[J].广西植物,2017, 37(2):169-185.

[10]贾永立.椰子叶片气孔特征的品种间比较[J].江西农业学报,2012,24(11)：14-16.

[11]刘静,王磊,邢怡等. 黑龙江苹果亚科植物叶表皮形态结构的研究[J]. 电子显微学报,2014,33(1):69-75.

[12]王燕青.利用SRAP标记构建菏泽牡丹优良品种指纹图谱[D].南京：江苏南京林业大学，2008.

[13]徐迎碧,丁之恩,巩如英,等.4个石榴品种叶表皮特征电镜扫描分析[J].安徽农业科学,2008, 36 (27):11709-11711.