鼻咽癌是耳鼻咽喉科较为常见的癌症之一，发病因素可能与当地湿热的环境气候及饮食偏辛辣有关[1]。鼻咽癌病死率较高，目前临床多采用放射治疗，原发性鼻咽癌在提高患者生存率等方面取得了显著成效，但手术时间较长，预后不佳且易造成患者面容改变[2]。通过抑制胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)的表达对鼻咽癌细胞系CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力的影响，检测CNE1细胞半衰期变化情况和相关蛋白变异后性质的表达[3]。现探讨在此蛋白基础上构建2条特异性针对IGFBP-rP1基因的小干扰RNA(siRNA32、siRNA34)，并采用各种临床检测技术对IGFBP-rP1基因和CNE1细胞的相关指标进行检测,分析抑制IGFBP-rP1基因的表达能有效治疗鼻咽癌且术后患者不易发生并发症。报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料 本研究所用CNE1细胞购买自中南大学高等研究中心细胞实验室，转染质粒购买自上海吉玛公司。

1.2 仪器与试剂 (1)材料：鼻咽癌细胞系CNE1细胞，空白载体，2条特异性针对IGFBP-rP1基因的小干扰RNA(siRNA32、siRNA34)，转录酶和逆转录酶。(2)试剂：Trizol试剂，秋水仙素，龙胆紫溶液，无酶RNA冲洗液，SYBR Green 1染料，上游引物，下游引物，dNTP。(3)RT-PCR、Western blot检测试剂：30 g丙烯酰胺和0.8 g N,N′-亚甲丙烯酰胺、4×Tris·Cl/SDS,pH 8.8、4×SDS电泳缓冲液，TEMED (N,N,N′，N′-四甲基乙二胺),10%过硫酸铵。(4)四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂：MTT 0.5 g，100 mL磷酸盐缓冲液(PBS)或无酚红培养基。(5)肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验试剂：无血清DMEM，1%胎牛血清DMEM,1640完全培养基(也可加到20%血清)，无菌PBS，胰酶，4%多聚甲醛固定液或甲醇，结晶紫染液[0.1%(g/mL)PBS结晶紫]。(6)细胞运动实验：等渗盐水,细胞运动导板。(7)流式细胞仪技术实验试剂：秋水仙素。

1.3 siRNA设计与构建 将IGFBP-rP1基因的DNA双螺旋结构通过解螺旋酶进行催化裂解打开成单链后，对其中之一的单链进行逆转录获得RNA，将此RNA进行PCR扩增后得到多条单链RNA，向这些多条RNA中加入rRNA进行蛋白质翻译后，再利用mRNA进行核糖体加成，然后形成siRNA[4]。

1.4 细胞培养及转染 将CNE1细胞置入琼脂培养基中放入细胞保温箱进行传代培养，将培养后的细胞随机分为4组即阴性对照组、空白组、siRNA32组(siRNA32转染)、siRNA32组(siRNA34转染)。其中空白组不做任何处理；阴性对照siRNA转染；siRNA32组与siRNA32组分别转染siRNA32转染和siRNA34转染。分别采用RT-PCR、Western blot检测各组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白的表达水平，使用细胞运动实验检测CNE1细胞的迁移能力，应用肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测CNE1细胞的侵袭能力、MTT法检测CNE1细胞的增殖能力、流式细胞仪技术检测细胞周期。8～10周期后分别对4组实验结果进行统计，分析数据结果。

1.5 检测方法

1.5.1 RT-PCR检测方法 4组细胞分别进行RT-PCR法检测，取冻存CNE1细胞，5 000 r/min离心40 min后放入无酶RNA，应用无酶RNA对各组细胞进行加速繁殖后，只去除较多的传代培养的各组细胞进行观察。

1.5.2 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测方法 4组细胞分别进行Western blot法检测，将培养的CNE1细胞放在2块干净的玻璃平板之间离心后备用，配制好的甲基丙烯酸酯分离胶液体并脱气，然后放入13%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌，混匀。按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的甲基丙烯百分比浓度，以上2种材料进行充分混合后将分离的CNE1细胞与混合液一起37 ℃温水中孵育40 min，充分清洗，再将硝酸纤维素膜与CNE1细胞混合显色。

1.5.3 细胞运动实验 4组细胞分别进行细胞运动实验，取冻存CNE1细胞，12 000 r/min离心30 min后应用等渗盐水制作等渗液细胞运动导板，CNE1细胞悬液滴在导板的同一高度，观察各组细胞的运动情况[5]。

1.5.4 肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验 4组细胞分别进行肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验，取冻存CNE1细胞10 000 r/min离心40 min，应用基质胶铺板制备CNE1细胞悬液，检测各组细胞侵袭情况[6]。

1.5.5 MTT法 4组细胞分别进行MTT法检测，取冻存CNE1细胞15 000 r/min离心40 min，每0.2 mL Trizol试剂裂解样本中加入0.15 mL氯仿进行裂解操作，26 ℃水浴加热采用无酶RNA冲洗液进行洗涤，再次15 000 r/min离心10 min，获得RNA，将此RNA进行逆转录后培养，检测各组细胞增殖情况[7]。

1.5.6 流式细胞仪技术 4组细胞分别进行流式细胞仪技术实验，取冻存CNE1细胞5 000 r/min离心45 min，向各组细胞中加入秋水仙素溶液，使细胞增殖的速度减缓从而使细胞固定在特定的细胞周期上，检测各组细胞的细胞周期。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以表示，多组间比较使用单因素方差分析法，组间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平结果比较 阴性对照组和空白组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1和图1。

 

表1 各组IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平结果比较

  

组别IGFBP⁃rP1mRNAIGFBP⁃rP1蛋白空白组1．000±0．0541．000±0．036阴性对照组0．986±0．1160．991±0．101siRNA32组0．182±0．101ab0．204±0．133absiRNA34组0．191±0．122ab0．230±0．119abF117．62998．675P<0．001<0．001

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

 

注：1表示空白组；2表示阴性对照组；3表示siRNA34组；4表示siRNA32组

图1 Western blot法检测各组IGFBP-rP1蛋白表达水平

2.2 各组细胞CNE1细胞迁移能力结果比较 阴性对照组和空白组CNE1细胞迁移数目比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞迁移数目显著低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

 

表2 各组细胞CNE1细胞迁移能力结果比较

  

组别CNE1迁移细胞数目(个)FP空白组87．64±7．1187．628<0．001阴性对照组85．10±8．24siRNA32组34．16±7．05absiRNA34组32．57±6．90ab

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

2.3 各组细胞CNE1细胞侵袭能力结果比较 阴性对照组和空白组穿过PVP-F膜的CNE1细胞数目比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组穿过PVP-F膜的CNE1细胞数目显著低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

 

表3 各组细胞CNE1细胞侵袭能力结果比较

  

组别CNE1细胞侵袭数目(个)FP空白组138．64±16．8761．044<0．001阴性对照组135．20±21．43siRNA32组51．61±9．58absiRNA34组50．38±10．32ab

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

2.4 各组细胞CNE1细胞增殖能力结果比较 培养24、48 h后，阴性对照组和空白组CNE1细胞增殖OD值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞增殖OD值显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05)。见表4。

 

表4 各组细胞CNE1细胞增殖能力OD值结果比较

  

组别24h48h空白组0．544±0．0461．142±0．163阴性对照组0．537±0．0591．126±0．154siRNA32组0．316±0．074ab0．652±0．177absiRNA34组0．308±0．091ab0．637±0．147abF41．55859．310P<0．001<0．001

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

2.5 各组细胞CNE1细胞增殖周期结果比较 培养48 h后，siRNA32组和siRNA34组G0/G1期、G2/M期细胞所占比例显著高于阴性对照组和空白组(P<0.05)；siRNA32组和siRNA34组S期细胞所占比例显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05)。见表5。

 

表5 各组细胞CNE1细胞增殖周期结果比较

  

组别G0/G1期S期G2/M期空白组53．20±2．6943．50±3．114．18±0．77阴性对照组53．69±2．8443．18±2．674．02±0．91siRNA32组71．15±1．95ab18．43±2．00ab11．76±1．05absiRNA34组72．03±2．15ab18．16±1．85ab11．51±0．97abF42．05678．29471．042P<0．001<0．001<0．001

注：与空白组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

3 讨 论

鼻咽癌病理病因目前认为与3种因素有关，即遗传因素、病毒因素(主要为EB病毒感染)、环境因素，临床对鼻咽癌的治疗方法很多，但治疗效果都不确切，现抑制鼻咽癌相关基因的表达对鼻咽癌进行靶向治疗[8]。

IGFBP-rP1是一种近年来被发现的胰岛素样生长因子泛素偶联蛋白，该蛋白翻译携带的鼻咽癌基因的独特高表达性与鼻咽癌的发生、发展密切关相[9]。IGFBP-rP1通过CNE1细胞上皮间充质胚胎转化后在鼻咽癌疾病进程中起癌基因作用，IGFBP-rP1能通过促鼻咽癌原癌基因表达而促进鼻咽癌细胞的增殖、转移、侵袭[10-11]。本研究结果证实，IGFBP-rP1对鼻咽癌细胞的干细胞特性具有调控作用，且证明IGFBP-rP1能经特异性siRNA载体而调控鼻咽癌相关基因的表达，实现其增强鼻咽癌干细胞特性的作用。本研究结果显示，可以通过抑制IGFBP-rP1表达而抑制鼻咽癌CNE1细胞的增殖、侵袭、转移。IGFBP-rP1培养数天后细胞迁移能力较强，说明IGFBP-rP1表达后有较多CNE1细胞进行迁移，提示鼻咽癌在该基因的调控下可发生较快迁移至其他组织器官，甚至会累及到较多的淋巴细胞。

活性炭本身作为一种多孔状碳元素吸附物质，在刚刚出厂时应当是粗糙且不平整的，从显微镜下观察能够发现其表面呈现出凹凸不平和孔洞型结构[2]。一般情况下，活性炭内部的孔隙呈现出无序的状态，但总体而言其孔隙结构越复杂、比表面积越大，吸附能力也就越强，活性炭质量越高。一般情况下测试活性炭性能的方法可以采用压汞法或氮气吸附法。压汞法的主要原理为：取小块活性炭进行压汞分析，观察活性炭再生工艺前后比表面积的变化情况；而氮气吸附法的原理在于通过多分子吸附理论来分析活性炭孔隙吸附质量，一般情况下前者适用于孔隙较大的活性炭检测，后者适用于微米级活性炭检测。

CNE1细胞RNA中的琥珀酸还原酶，能使外源性MTT氧化还原为不溶性的甲瓒并沉积细胞，但死细胞无此功能[12]。当细胞增殖时并不影响甲瓒在CNE1细胞中的数量，会随着细胞增殖而分裂增多，伴随细胞质中不断裂解为更小的粒子，当CNE1细胞增殖趋向最大化完成时，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在700 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活CNE1细胞增殖的数量[13-15]。本研究结果显示，IGFBP-rP1相对表达量均值较低，说明表达基因产物与鼻咽癌的特异性较高。而IGFBP-rP1增殖较多CNE1细胞，说明该蛋白表达后鼻咽癌相关细胞会出现高增殖效率。不同细胞周期进行抑制IGFBP-rP1时所产增殖的细胞数量、迁移、侵袭性不同，表明在特定时期对该蛋白进行抑制能有效治疗鼻咽癌。

本研究创新性在于通过抑制IGFBP-rP1基因表达对鼻咽癌系细胞进行靶向定位治疗，可避免临床其他手术治疗的不确定性。该手术利用基因抑制法可增强患者预后，鼻咽癌系细胞增殖率、转移率、侵袭周围其他组织的概率极大地降低，值得临床其他难治性手术的借鉴。

综上所述，探讨抑制IGFBP-rP1可有效抑制鼻咽癌细胞系CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力，安全可靠，值得临床推广使用。

信道冲激响应是描述无线信道中最重要的一个信道参数，多普勒谱、时延功率谱都是在信道冲激响应的基础上进行处理获得的。

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