克里米亚-刚果出血热（Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF）是一种蜱传烈性传染性疾病。流行于非洲、欧洲、亚洲及中东地区 ［1］。我国首例CCHF患者在新疆被发现，亦称为新疆出血热，可高达80%病死率［2］。CCHF疾病的传播主要是通过蜱虫叮咬、接触传染性病人或者被病毒感染的血制品污染［3］，曾有奶牛血溅入眼中发病的病例报告［4］。发病者以农场工人、畜牧场工人及医务工作者为多［1］，人群对CCHF普遍易感。CCHF起病急，临床症状有头痛、高热，疲劳，肌肉酸痛，腹痛，出血或休克［5］，重症患者预后较差。由于CCHF研究的局限性，尚未研制出有效的疫苗，也没有特异的方法进行疾病治疗［6］。

感染克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）可引起CCHF疾病，CCHFV属于布尼亚病毒科内罗病毒属负链RNA病毒，其基因组由三个节段构成，L编码RNA聚合酶、M编码糖蛋白和S编码核蛋白。CCHFV在病原体分级上属于生物安全四级（BSL-4），传染性强，传播力大，有被用于恐怖袭击的风险 ［7］，危害性较大。CCHFV的检测技术发展对于反恐及生物安全防控具有技术支撑作用。

目前，CCHF的实验室诊断主要有血清学诊断、分子生物学方法和病毒培养等方法。

1 血清学方法

1.1 ELISA方法

国内有学者采用ELISA和反向被动血凝抑制试验 （RPHI）对羊血清检测 CCHFV-IgG 抗体［8］；王敏等 ［9］对疑似登革出血热病人血清进行CCHFVIgG抗体检测时，检出较高的阳性率；韩磊［10］等以ELISA方法检测CCHFV-IgG和IgM抗体及抗原;Lwande OW ［11］采用ELISA法检测CCHFV-IgG和CCHFV-IgM抗体，用来分析暴露人群的感染情况。这些ELISA方法的检测由于操作简单，有一定的敏感度和特异性，在临床检测中具有一定的适用性。

1.2 免疫荧光技术

Saijo等［12］用Hela细胞采用免疫荧光分析方法检测CCHFV；有国内学者采用间接免疫荧光分析（IFA）和Dot-ELIS方法检测羊血清 CCHFV，从2%的羊血清中检出CCHFV抗体，结论认为Dot-ELISA方法比IFA敏感，但IFA方法更快速［13］。

李云峰［21］等采用荧光微球与PCR及杂交等方法相结合建立液相芯片检测CCHFV。具有快速敏感、高通量、特异的特点；曹佳媛［22］建立了 CCHFV的荧光可视化基因芯片检测方法。实验中形成生物素-链霉亲和素-纳米金复合物，通过银增强试验对检测信号再次放大，从而实现可视化。

1.3 空斑减少中和试验（PPRNT）

2.数据的风险：人工控制信息，系统可以修改原有的数据 ，比如公式的定义和修改之后的结果，如数据源的有意修改等。关于公式、虚假报告的生成、回归到正常公式、删除修订标志、审核员都非常困难。报告必须要保证它的正确性和准确性，这就需要审计师协调审计单位内部来完成最后的审计工作，就现在而言，审计工作虽然在不断地改进工作，但是由于信息技术发展过快，两者的发展状况并没有在同一条水平线上，另一方面，审计的工作人员自身的业务水平也各不相同，设计最后得出的结果就会实际情况出现偏差。风险也会增加。

2 分子生物学检测

2.1 RT-PCR

马本江［23］等测定CCHFV中国分离株M基因的全部序列。以单一PCM Tag和DNA聚合酶扩增出完整的M基因，扩增产物纯化后作为模板进行病毒基因序列测定；孙素荣［24］等对新疆地3株CCHF病毒株进行S基因序列测定，从而分析比较其分子生物学遗传特性。

2.2 可视化逆转录环介导等温扩增 （RTLAMP）检测法

干预后对照组认知功能因子、独立功能因子、社会/自制因子评分较观察组低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 基因芯片检测方法

翻转课堂教学中，学生可自主选择学习时间段，掌握学习进度和深度，采用多样化学习形式，学习兴趣增强，学习态度更为积极主动，实现个性化的学习；老师课外通过学习平台与学生的互动交流，总结分析学习多方面的反馈信息，掌握学生课外的学习状况，精心设计课堂教学活动，实施开展差异的指导和教学课堂，有效提高课堂效果。

魏鹏飞［25］利用DNA重组及克隆技术，用CCHFV的多克隆抗体和单克隆抗体对克隆后的表达产物进行抗原表位的检测和分析。研究确定CCHFV结构蛋白的抗原特性，有助于CCHFV感染与免疫机制的阐明，也将为疫苗的研制提供理论基础。

韩一芳［20］等体外合成CCHFV的S基因，通过构建重组质粒体外转录为模板RNA，合理设计LAMP引物，建立了可视化RT-LAMP反应体系。结论认为和实时定量RT-PCR检测法相比，RTLAMP稳定性好，不会产生交叉反应，快速廉价、操作简单、灵敏度好、特异度高，无需开盖即可直接观察结果。

Canakoglu N［14］采用 PPRNT 方法检测 CCHF 病毒中和抗体，认为此种检测方法在CCHF病毒感染流行病学研究及疫苗研制和免疫学研究中都有重要的意义。

2.4 基因测序

RT-PCR是检测病毒的一种较为普遍适用的方法。Yapar M ［15］等利用 RT-PCR检测CCHFV；I-brahim SM［16］等采用 RT-PCR 检测 CCHFV 及其他几种出血热病毒，并比较了方法的敏感性和特异性；袁帅等［17］分析CCHFV S基因片段核酸序列的保守性，建立了CCHFV实时荧光RT-PCR方法；赵晓冬 ［18］等采用RT-PCR检测方法检测CCHFV核酸，同时采用透射电镜超薄切片方法进行CCHFV的形态学鉴定；夏宇尘等［19］采用两步逆转录法成功检测了CCHFV。以上学者认为RT-PCR检测方法灵敏快速，能准确地检测CCHFV。

2.5 基因克隆

为了使工程测量实验室安全管理评价指标能够得到合理的量化处理，应根据各高校工程测量实验室的实际情况来确定安全管理的测度，以便确定安全管理中的重点管理因素.在工程测量实验室安全管理评价之前，假设任何事件发生的概率是相同的，则安全管理评价测度应均等划分.然而在实际的安全管理当中，测度越高，事件发生的概率越大，为了与实际情况相吻合，应提高最高等级的测度，并扩大取值范围，从而提高工程测量实验室安全管理评价的科学性和准确性.

许晴呢，天生有种瘫在蓝丝绒大床上的贵族娇病气质。她像殷桃演的莫莉，同性对她千般不悦目，异性为她颠三倒四。她却对谁都仿佛，“哼，管他的。”

3 病毒培养

CCHFV病毒培养需在四级生物安全实验室进行。因此，能达到病毒培养条件的实验室并不多。Weidmann M［26］等学者对几种出血热病毒的培养液进行了培养效果的分析，CCHFV病毒培养的效率是最低的。Ferraris O［27］等学者利用CCHFV培养转染Vero E6和Hun 7细胞株，用以研究CCHFV抑制剂的作用。病毒培养用于临床及科学研究的意义是很大的，值得进一步研究。

4 展望

由于CCHFV是生物安全四级的病原体，其致病性强，病死率高，还有用于恐怖袭击的风险。尤其是在国境口岸，防止CCHF的传入及防范恐怖安全的风险使CCHFV的监测成为一项重要的工作内容。

在CCHF的检测技术方面，以血清学检测及分子生物学检测为主。细菌培养随着生物安全实验室的级别达到要求，将越来越受到重视。临床诊断及科学研究方面，要根据需求结合多种方法进行组合。

在临床应用中，血清学检测方法要严格遵守样本的采集时间，而且有可能产生交叉反应，适用于CCHF的筛查。在CCHF发病早期，应及时采集血清，可利用RT-PCR方法进行早期快速检测，也可以选择CCHFV-IgM检测综合判断；在疾病过程中，采集不同疾病时期的血清检测CCHF-IgG抗体。通过抗体情况反映疾病的进程。

目前，随着实时荧光PCR仪和基因芯片技术的进展，以及RTLAMP检测法等可视化检测技术及基因克隆技术的探索及应用，将使CCHFV的检测实现早期特异快速、灵敏准确、自动化，为CCHF疾病的检测及监测、防控提供理论基础，为CCHF疾病的监测和防范传入及恐怖安全风险提供技术支撑。

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