褐飞虱主要以水稻为食，是粮食作物重要害虫之一，成虫具有明显的翅二型现象，即无飞翔能力的短翅型和能作长距离飞翔的长翅型。长翅型为迁飞型，在营养状况恶化时可向外迁移；短翅型则为定居型，发育较快，且繁殖能力强。这两种型性可相互转变，其发生动态是该虫数量预测中的一个重要参数(张琼秀等, 2007)。

最近，我们在白背飞虱中鉴定到一个蛋白点为胰岛素酶，并发现胰岛素酶在5龄短翅若虫中的含量比在5龄长翅若虫中的含量要高出3-4倍。由于已有报道：褐飞虱脑分泌的胰岛素可通过与两个胰岛素受体(InR1和InR2)的结合，参与了翅型分化的调控，从而促进了长翅表型的发生(Xu et al., 2015)。由于胰岛素酶是胰岛素代谢过程中的关键酶，故我们推测胰岛素酶通过对胰岛素或者胰岛素样生长因子的降解而起到了对飞虱翅型分化的调控作用(Liang et al., 2016)。

综合管理信息平台的建立能够为基层管理人员提供实时准确的数据信息，为中层管理人员提供详细的管理信息，为高层管理者提供决策信息，提高整个学校的办公效率和管理水平，最终实现“数字化校园”的构想。

褐飞虱和白背飞虱为稻飞虱的主要种类，亲缘关系很近，蛋白同源性高。本单位已建立褐飞虱的转录组数据库，且褐飞虱的基因组数据库也已公开发表，因此本文拟通过已获得的白背飞虱胰岛素酶部分氨基酸序列从转录组数据库中查找获得褐飞虱胰岛素酶的cDNA序列，通过生物信息学等方法确定具体的开放阅读框，再在褐飞虱基因组数据库中进行搜索比对，确定褐飞虱胰岛素酶基因的外显子和内含子，最后还分析确定了该基因上游3 000 bp序列中的CpG岛，为今后进一步研究该基因在稻飞虱翅型分化中的具体调控机制、及其表达是否受到甲基化调控打下前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料

白背飞虱胰岛素酶的两段氨基酸序列为本实验室测得，具体序列如下：

(1)YKSALTVKKTLLNIPATQVTKLDNGLRVA

SEDSGASTATVGLWIDAGSRSENDKNNGVAHFLEHM

——因地制宜，特色发展。根据区域特点和资源禀赋，以市场为导向，因地制宜，科学规划，积极开发特色化、差异化、多样化的乡村旅游产品，防止大拆大建、千村一面和城市化翻版、简单化复制，避免低水平同质化竞争。

(1) 城市轨道交通结构下穿既有高架桥时，采取桩基托换方案。如深圳地铁一号线一期工程老街—大剧院区间下穿广深高速铁路桥等。

AFKGTAKRSQTDLELEVENMGAHLNAYTSR (共95个氨基酸)

Liang ZQ, Song SY, Liang SK,et al. Analysis of differential proteins in two wing-type females of Sogatella furcifera (Hemiptera:Delphacidae) [J]. Journal of Insect Science, 2016, 16 (1): 1-7.

(2)TNMLLQLDGTTPICEDIGR (共19个氨基酸)

Tennant河地区主要为管状(筒状)。矿床总体在深部的蚀变作用为钠质蚀变组合，在中浅部为钾质蚀变组合，而在浅部则为绢云母化和硅化；以磁铁矿为主的矿化以钠质蚀变为主，以赤铁矿为主的矿化以钾质蚀变为主。该区有经济价值的金-铜-铋矿化大多数与单个富磁铁矿或其相当的氧化矿相伴，呈现高的航磁异常，矿体地表露头以褐铁矿为主，深部以磁铁矿为主，高品位的金通常位于铁矿体底部，呈细脉-浸染状产出。铁矿的形状从近于圆形到筒状，长轴通常沿着EW向的裂隙，产出于元古代变质细粒沉积层系中，部分含有浸染磁铁矿。

褐飞虱基因组序列已发表，编号为GCA_000757685.1_NiLug1.0_genomic.fna。

1.2 褐飞虱胰岛素酶基因cDNA序列的获得和分析

本地运行tblastn程序，选取白背飞虱胰岛素酶中的已知的两段氨基酸序列作为待查询序列，在褐飞虱的转录组数据库中进行搜索。再用生物信息学等方法对查找获得的序列进行分析，确定其开放阅读框和所编码蛋白的特征。

1.3 褐飞虱胰岛素酶基因外显子和内含子的确定

本地运行blastn程序，将上述获得的褐飞虱胰岛素酶基因开放阅读框序列与褐飞虱基因组序列进行比对，发现褐飞虱胰岛素酶基因开放阅读框序列在全基因组序列中被很多非编码序列隔开，从基因翻译起始位点开始被隔开的编码序列即为外显子，而插入到编码序列中且与编码序列相邻的非编码序列即为内含子。

褐飞虱转录组数据库为本单位张文庆教授课题组建立。

1.4 褐飞虱胰岛素酶基因上游序列CpG岛分析

本地运行blastn程序，将上述获得的褐飞虱胰岛素酶基因开放阅读框序列与褐飞虱基因组序列进行比对，发现褐飞虱胰岛素酶基因开放阅读框序列在全基因组序列中被4条非编码序列隔开，从基因翻译起始位点开始被隔开的编码序列即为外显子，共有5个外显子，其序列大小分别为147 bp、126 bp、78 bp、684 bp和390 bp；而插入到编码序列中且与编码序列相邻的非编码序列即为内含子，共有4个内含子，其序列大小分别为75 pb、66 bp、50 bp和58 bp，外显子序列加上内含子序列的总长度为1 674 bp，具体见图4。

2 结果与分析

2.1 褐飞虱胰岛素酶基因cDNA序列的获得和开放阅读框分析

选取白背飞虱胰岛素酶中的已知的两段氨基酸序列作为待查询序列，在褐飞虱的转录组数据库中进行搜索比对，同源性最高的片段为同一片段，序列长度为2 784 bp。利用NCBI网站ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 对该片段进行分析，结果显示，起始密码子ATG位于132-134 bp处，其下游1 554-1 556 bp处为终止密码子TGA，组成最大的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为1 425 bp(图1)，详细序列见图2，编码474个氨基酸。

  

图1 转录组片段的开放阅读框预测Fig.1 Open reading frame analysis of transcriptome fragment

 

图2 褐飞虱胰岛素酶基因开放阅读框序列

Fig.2 The open reading frame sequence of the insulinase gene of Nilaparvata lugens

使用NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/blast.cgi)blastx软件在非冗余蛋白序列数据库中进行搜索，结果发现与多种昆虫或其它生物的胰岛素酶蛋白高度同源，褐飞虱胰岛素酶基因的开放阅读框所编码的蛋白质具有胰岛素酶的典型结构：Peptidase_M16超家族和Peptidase_M16_C超家族(图3)，这进一步肯定了我们所获得的褐飞虱胰岛素酶基因的开放阅读框序列是正确的。Peptidase_M16为胰岛素酶的功能域，具体发挥酶的功能，而Peptidase_M16_C则为胰岛素酶的非活性域，可能在靶向底物中发挥作用。

  

图3 与褐飞虱胰岛素酶基因开放阅读框序列所编码的蛋白同源的保守域Fig.3 The conserved domains of homologous proteins

2.2 褐飞虱胰岛素酶基因的外显子和内含子

选取该酶基因上游序列3 000 bp，利用Softberry的在线软件CpGFinder进行分析(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=promoter&topic=cpgfinder)，确定CpG岛的数量和位置。

  

图4 褐飞虱胰岛素酶基因的外显子和内含子Fig.4 Exons and introns of the insulinase gene of Nilaparvata lugens

2.3 褐飞虱胰岛素酶基因上游序列CpG岛分析

选取该酶基因上游序列3 000 bp，利用Softberry的在线软件CpGFinder进行分析，规定CpG岛的序列要满足如下条件：长度要大于200 bp，G+C含量的观察值/期望值(Observed/Expected)的比值大于0.6，G+C含量大于50%。结果在上游序列320 bp处到858 bp处发现了一个CpG岛，长度为539 bp，G+C含量的观察值/期望值的比值为0.85，G+C含量占比为52.3%。

3 结论与讨论

本文通过已获得的白背飞虱胰岛素酶的部分氨基酸序列，成功从褐飞虱转录组数据库中比对到带有褐飞虱胰岛素酶基因的cDNA序列，并通过NCBI网站ORF finder 对该序列进行开放阅读框分析，结果显示该序列含有一个带有起始密码子ATG和终止密码子TGA的开放阅读框，全长为1 425 bp，编码的蛋白质具有胰岛素酶的典型结构：Peptidase_M16超家族和Peptidase_M16_C超家族(Yfanti et al., 2008)。再将已知的开放阅读框序列与褐飞虱基因组序列进行比对，发现褐飞虱胰岛素酶基因共有5个外显子和4个内含子，外显子序列加上内含子序列的总长度为1 674 bp。这是首次有关褐飞虱胰岛素酶基因结构的详细报道，为该基因的体外表达和功能研究打下了良好基础，将有利于今后进一步探索该酶参与调控稻飞虱翅型分化的具体机制。

有关稻飞虱翅二型现象的研究所取得的一个非常重要的成果，就是发现褐飞虱胰岛素受体在长、短翅分化中起着关键性的决定作用，当受体2含量低时，胰岛素信号转导通路就会开启，褐飞虱就能生成长翅型，而当受体2含量高时，转导信号就会关闭，褐飞虱就能生成短翅型(Xu et al., 2015)。由于胰岛素受体的上游直接配体是胰岛素，而胰岛素的含量又受到胰岛素酶的影响，因此胰岛素酶应该是稻飞虱翅型分化调控过程中的上游因子，在白背飞虱中发现胰岛素酶在5龄短翅若虫中的含量比在5龄长翅若虫中的含量要高出3-4倍的事实，说明胰岛素酶对飞虱翅型分化的调控起到了一定作用(Liang et al., 2016)。

那么胰岛素酶含量在不同翅型的稻飞虱中为何存在差异？其机制是什么？尚未见诸报道。我们的研究发现无论在褐飞虱还是在白背飞虱中均存在基因组甲基化现象，且在不同翅型的飞虱中基因组甲基化式样和水平明显不同(Zhou et al., 2013; Zhang et al., 2014; Liang et al., 2015; 张梅等, 2015; Zhang et al., 2015)。本研究发现褐飞虱胰岛素酶基因上游320 bp至858 bp处存有一个CpG岛，而基因组甲基化通常发生在基因上游的CpG岛区域，从而调控基因的表达(梁士可等, 2014)。因此推测胰岛素酶基因上游320 bp至858 bp 处的CpG岛可能存在甲基化现象，且在不同翅型的飞虱中甲基化水平存在差异，从而导致胰岛素酶基因表达水平在不同翅型的飞虱中也存在差异，最终影响翅型分化。目前本项目组正准备对这一推测进行实验验证，将有助于深入认识稻飞虱翅型分化的机制。

参考文献(References)

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对对照组患者给予甲硝唑进行治疗（北京天惠参业股份有限公司生产，国药准字H20053396），每天晚上患者对外阴部进行正常清洗，然后采取平卧位将甲硝唑放置到阴道深处，每次1粒，时间为7天。对观察组患者采取雌激素联合甲硝唑进行治疗，雌激素（新疆新姿源生物制药有限责任公司生产，国药准字H20090172），采用口服的方式，每2周1次，剂量为2 mg，时间为3个月。甲硝唑治疗与对照组相同。

Xu HJ, Xue J, Lu B,et al. Two insulin receptors determine alternative wing morphs in planthoppers [J]. Nature, 2015, 519: 464-467.

实验组教师教学效果评估及学生成绩评估均优于对照组（P＜0.05）；尤其是临床思辨及操作技能成绩，实验组较对照组提高幅度更为显著，除了操作更为熟练和规范外，实验组学生与患者的沟通及人文关怀能力有明显提高，分析和处理临床问题的能力和灵活性也较对照组有显著的提升。但两组中考核优秀人数及不及格人数差异无统计学意义（P＞0.05），我们考虑可能与样本量少有关（表1）。

1.3.1 电极脱位(移位) 过去认为植入起搏器是安全的，不必心电监护，致使对有电极脱位等情况者观察不到位。实际上，电极脱位是最常见的并发症之一，发生率为2% ～8%，其中90%发生在1周内，24 h内尤易发生。电极脱位心电图表现为间歇起搏或起搏失效。

Yfanti C, Mengele K, Gkazepis A,et al. Expression of metalloprotease insulin-degrading enzyme (insulysin) in normal and malignant human tissues [J]. Int. J. Mol. Med., 2008, 22 (4): 421-431.

北宋时期儒学的兴盛，士风的浸染使得伦常纲纪深入人心。靖康之变后，遭遇国难的士大夫对于忠君这个问题也格外敏感，冯道不可避免地成为批判的靶子。

Zhang M, Chen JL, Liang SK,et al. Differentially methylated genomic fragments related with sexual dimorphism of rice pests, Sogatella furcifera[J]. Insect Science, 2015, 22 (6): 731-738.

1.2.3 培训内容 针对问卷调查的结果，确定相应的培训内容。主要为:①腰背痛产生的原因、预防、锻炼。②力学的原理，节力原则及运用。③正确的各种预防腰背痛发生的姿势、各项正确的护理操作。

Zhang M, Chen JL, Zhou XS,et al. Different genomic DNA methylation patterns between male and female adults of white-backed planthoppers Sogatella furcifera [J]. Journal of Asia-Pacific Entomology, 2014, 17 (4): 917-921.

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