检疫辐照处理是指利用电离辐射技术对有害生物进行辐照处理后，使其致死、正常发育停止或不育，是防止检疫性有害生物传入和(或)蔓延，及限制非检疫性限定有害生物产生经济影响的一种物理方法，其中60Co放射源发出的γ 射线是植物有害生物检疫处理中最简便有效、最常用的射线。相对于目前常用的化学熏蒸处理(溴甲烷、磷化氢)和物理处理(冷冻处理(0-2℃)、热激处理(44℃-48℃)等检疫处理办法，该处理技术具有快速高效、无需拆开产品包装、无需改变温度、无化学残留的特点。

辐照作为植物检疫单一或综合处理技术在口岸的试剂应用中所面临的一个难点是：通常情况下能导致有害生物直接致死的辐照剂量往往会对寄主水果同样造成极大的伤害。如果要求经辐照处理后商品中的害虫在1 d 之内死亡, 则需较高剂量的辐照处理, 但高剂量的辐照处理会严重影响商品的品质；而采用较低剂量(100-500 Gy)辐照处理, 处理后的害虫在一定时间内死亡或不产生下一代也可达到相同的检疫除害目的(Anisimov, 1989)。因此，在检疫中需要建立判别所截获活体害虫是否经过有效辐照处理的科学标准并对其有效性进行广泛地验证。

同时，辐照处理对靶标生物的作用效应在很大程度上具有随机性和非定向性，它既可能导致染色体结构的改变，也可能导致基因组单个位点发生潜在的未知突变或代谢调控变化等多种路径异常而产生的综合效应(Gulston, 2002; Dong, 2014)。目前国内外有关辐照处理效应的分子机理(如不育)仍缺乏明确的认识，因此，大多数国家对植物有害生物辐照处理有关的剂量标准仍难以达成统一的共识，这在某种程度上限制了该技术的推广应用。争议的焦点问题在于：若采用相对较低的经验剂量是否存在除害处理效果不彻底的风险？而采用较高的辐照剂量是否对寄主水果造成损伤导致经济损失并增加不必要的处理成本？因此，筛选与辐照不育相关的分子标记，既能较准确地反映导致靶标害虫不育的标准剂量，又尽可能地减少能耗以及对被照寄主果实的损伤，是辐照处理技术研究需要解决的关键基础性问题。

本研究以我国重要检疫性害虫—新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes Beardsley为研究对象，采用RNA-seq技术分析不同辐照剂量处理下虫体RNA转录组表达谱的差异性以及相关功能基因的表达变化模式，目的是从整体水平评估辐照处理对新菠萝灰粉蚧基因表达的影响，从而为进一步找到合适的辐照条件提供了依据。

1 材料和方法

1.1 供试虫源

供试新菠萝灰粉蚧采自湛江徐闻种植的剑麻，室内接种于南瓜上继代饲养至第15代。

1.2 辐照处理

为保证辐照处理材料的同质性，辐照虫态选择7 d龄雌成虫，辐照剂量参考马骏等的处理方法(Ma et al., 2013)分别设对照(剂量为0 GY)、100 GY和240 GY共3组剂量梯度，供试虫体连同寄主南瓜在广州辐锐高能技术有限公司采用60Co辐照处理，每一剂量辐照虫体数30头以上，重复3次。当处理达到设定辐照剂量后，置室内饲养24 h，收集样本置于RNA保护剂中保存并用干冰寄送诺禾致源生物信息科技有限公司进行RNA提取和测序实验。

1.3 RNA提取和转录组文库构建

处理样本使用TRIzol(Invitrogen)试剂盒提取总RNA，经DNasel处理后，用带有Oligo(DT)的磁珠富集mRNA，加入打断试剂将mRNA打断成短片段，再以此为模板合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经纯化回收3′末端加A、连接测序接头后，进行PCR扩增从而得到样本的cDNA文库。构建好的文库经Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-time PCR System质检合格后使用Illumina Hiseq 2000平台进行测序。

而关于检疫辐照处理对进出口的水果、肉类等货物本身质量的影响已经有相当多的报道，如Thang等对蓝莓和樱桃两种水果使用400 Gy的辐照和溴甲烷熏蒸这两种两种常用检疫处理方法，比较发现使用辐照处理的水果在除口感上偏软外，味道、贮藏时间都没有收到显著影响，而沙门氏菌和单增李斯特氏菌的数量都有明显下降；而使用溴甲烷熏蒸过的水果则收到更多的损伤，贮藏时间缩短11%-14%，且霉菌生长更多(Thang, Au et al., 2016)。Shahbaz等(2014)对石榴采用0.4 kGy、1 kGy、2 kGy共3个辐射剂量的梯度实验来观察不同辐照剂量下石榴的味道品质变化情况，发现尽管果肉中的抗氧化剂、多酚和花青素与辐射剂量存在显著的正相关关系，但在强度为0.4 kGy的辐射条件下，这些影响水果味道的物质相对于未受到辐照处理的对照组并没有显著的差异。这些结果表明适当的辐照不但不会影响产品质量，甚至在储藏时间和抑制霉菌生长等方面还有所提升。

1.4 转录组测序结果分析

测序平台输出的原始数据(raw reads)通过质量控制(QC)过滤去除接头序列和低质量的读长(reads)后得到高质量的净读长(clean reads)，将去重复的净读长用Trinity软件进行De novo组装。将净读长通过组装软件组装成转录本后，用Tgicl将其进一步去冗余和拼接得到Unigene。将所得到的Unigene集通过Blast比对至NT、NR、COG、KEGG、SwissProt数据库进行功能注释。并基于NR注释结果对Unigene集通过Blast2GO进行GO功能注释。

1.4.1 De novo组装和功能注释

1.4.2 Unigene差异表达分析

基因表达量的变化体现了物种在应对环境变化时体内的生理生化反应，要探究辐照条件对新菠萝灰粉蚧的影响，首先需要找到辐照条件下发生差异表达的基因。为了标准化基因表达量，利用RSEM软件根据 Reads PE关系和长度、以及 Reads 唯一比对上Unigene的fragment的长度分布、比对碱基质量值和比对转录本起始位点等后验概率信息，运用基于后验概率的贝叶斯模型和最大期望的算法建立最大似然的概率估计模型，从而区分Reads来自哪些Unigene。再通过计算FPKM( Fragment Per Kilo bases per Million Reads )，即每百万Reads中来自某一基因每千碱基长度的fragment数目，来估算基因表达水平，基因表达量分布结果基本服从泊松分布模型。标准化基因表达量后，通过DEGseq和DEseq2软件包计算实验组和对照组之间基因差异表达的情况，其中Foldchange≥2，且FDR≤5%的基因被标记为存在显著差异表达。

例（40）是“A到VP”格式作宾语的类型，“自己笨到没朋友了”作“感觉”的宾语。例（41）是“A到VP”格式作补语的类型，“离谱到想抽自己”作“错”的补语。例（42）是“A到VP”格式作定语的类型，“实力低到爆”作“角色”的定语。例（43）是“A到VP”格式作谓语的类型，“方便到你都不相信这在祖国”作句子谓语。

FPKM计算公式为为唯一比对到基因的 fragment数，N为唯一比对到参考基因的总fragment数，而L为基因的碱基数。组间差异表达计算通过DEGseq和DEseq2软件包，其中Fold-change ≥ 2，且FDR ≤ 5%的基因被标记为存在显著差异表达。

1.1 试验材料 供试蔬菜品种包括生菜、菠菜、青菜。其中生菜：四季奶油生菜、美国四季油麦菜、极品红油麦、结球生菜、汉斯八宝菜；菠菜：日本全能大叶菠菜、香港速生大叶菠菜、武波一号、四季大叶菠菜、紫妃菠菜；青菜：矮箕苏州青、双龙精品快菜、热矮001、东方2号、东方18。供试营养土为广东生升农业有限公司生产的基质，草炭∶珍珠岩∶蛭石按照体积比1∶1∶1混合而成。为使种子萌发整齐一致，在清水中浸种12 h，将种子用干净的湿润毛巾或者纱布包裹，放在25 ℃左右的恒温培养箱中催芽，露白后点播。

2 结果与分析

2.1 测序原始数据处理和组装

本研究对3个组别的各自3个生物学重复共9个文库进行了测序，对raw reads进行去接头处理和去除低质量reads后得到的clean reads数占总reads数的比例全都在97%以上(表1)。得到的clean reads进一步组装和去冗余得到76 878个Unigene, 其中最短的片段长度为200 bp，最长的片段长度为13 451 bp， Unigene平均长度为820 bp左右， GC含量约为41.5%。

 

表1 原始数据过滤统计

 

Table 1 Statistics of raw data filtering

  

类别TypeCK_1CK_2CK_3Db1_1Db1_2Db1_3Db2_1Db2_2Db2_3读长长度Readslength100100100100100100100100100读长总数TotalReads485800584940325041091840494030564594431848412206464099184302046446637614净读长总数Totalcleanreads474907684826871840124798482540064480788847308274453438104205336845582020净读长占比(%)Cleanreadspercentage97.7697.797.6597.6797.5397.7297.797.7597.74接头读长总数Totaladaptorreads902092628674762486967090761081167674接头读长占比(%)Adaptorreadspercentage0.020.020.020.020.020.010.020.020.02低质量读长总数Totallow-qualityreads1080270112527095836811414261127734109684210584989589801047920低质量读长占比(%)Totallow-qualityreadspercentage2.222.282.332.312.452.272.282.232.25净读长GC含量CleanreadsGCpercentage40.5040.3140.3140.2841.2239.9940.1440.8040.18净读长Q20占比(%)CleanreadsQ20percentage98.0898.0998.0698.1697.9998.1498.0998.0198.11净读长Q30占比(%)CleanreadsQ30percentage93.6193.6693.5793.8793.3893.8093.6993.3993.72

2.2 Unigene功能注释

将组装得到的Unigene集通过Blast比对数据库进行功能注释，注释数库包括:NT、NR、COG、KEGG、SwissProt。各个数据库比对上的Unigene数分别为NR数据库81 767个、NT数据库91 753个、COG数据库35 498个、KEGG数据库52 621个、SwissProt数据库59 496个。而在所有不同数据库间均同时能比对上的Unigene数为25 981个。数据库间Unigene的交集见图1。根据NR注释信息，使用Blast2GO软件得到Unigene的GO注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，再利用WEGO软件对所有Unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识新菠萝灰粉蚧的基因功能分布特征(图2),Unigene的GO聚类结果显示，在所有三大功能注释类别中，生化过程类别有显著富集的子类别包括细胞形成过程、代谢过程和单生物过程，在细胞组分类别中则是细胞结构、细胞器等子类富集最多，而在分子功能类别Unigene显著富集的则包括分子结合、酶活性等子类。根据功能注释结果，按照NR，SwissProt，KEGG，COG的数据库优先顺序，挑选Unigene的最佳比对片段作为该Unigene的CDS，并根据标准密码子表将编码区序列翻译成氨基酸序列，从而得到该Unigene编码区的核酸序列和氨基酸序列。未能注释上的Unigene使用上一步预测的CDS作为模型进行建模，然后使用ESTScan进行预测。进行Blast比对后总共得到91 813个CDS序列，同时通过ESTScan预测得到3 826个CDS序列。

  

图1 NR、NT、COG、KEGG以及SWISSPROT功能注释维恩图Fig.1 Venn diagraom of annotated genes in NR, NT, COG, KEGG and SWISSPROT注：图中数字为相应数据库注释上的Unigene数目。Note: The numbers in the plot are Unigenes that matched to corresponding annotation database.

  

图2 Unigene GO分类Fig.2 Unigene gene ontology classification

2.3 Unigene基因差异表达分析

功能注释后的Unigene集利用RSEM软件计算比对上每个Unigene的reads数，结合Unigene有效长度以及比对上的reads数，通过计算FPKM值来标准化表达量。

在两个不同的实验组中，低剂量组相对对照组存在差异表达的基因总共有3 122个，其中表达量上调的有742个，表达量下调的有2 380个；而高剂量组存在差异表达的基因总共有4 239个，表达量上调的有1 665个，表达量下调的则有2 574个。而在这些基因中，在两个辐照条件下都发生差异表达基因总共有2 307个。结果见图3。可见在高剂量的辐射条件下，新菠萝灰粉蚧的基因表达波动比低剂量辐射条件下要更为剧烈，受影响的基因类型更多，对生物生理生化的影响更广。

2.4 差异表达的基因聚类和功能分析

DEA方法的一个重要功能在于，可以通过找出投入要素的冗余和产出的不足，进而有针对性地为战略决策和发展路径提供转变的方向和程度。该研究更加注重投入最小和最小投入下高新技术企业利益最大化，所以分析中采用CCR模型。DMU4企业的纯技术效率<1，说明该企业的投入存在一定的冗余，可通过投影分析比较发现投入无效率的要素，从而更好的为高新技术企业发展提供量化的参考依据。在此，借助软件(DEA-SLOVER3.0)对DMU4高新技术企业进行超效率DEA分析，运行后的结果显示如表4。

因此，腹腔镜手术实际操作过程仍有一定难度，基层医院经常会选派优秀外科医师进修学习。但是由于许多基层医师一心追求手术操作，忽视基本技能训练，操作过程中存有一些不良习惯（如进出器械缺乏距离感，过快过猛；经常术中操作器械“丢失”等），让带教教师无法放心。加之目前医患矛盾加剧、医患关系复杂，在传统意义上“师傅带徒弟”医学培养模式中，“师傅”更加难以放手让“徒弟”实践，导致进修医师总是抱怨实际动手操作机会过少，进修学习收获不大。针对这一点，我们在临床带教过程中，使用腹腔镜模拟训练器进行微创外科手术基本操作规范培训，并在后期实际手术中检验发现，经过培训的进修医师各项技术水平明显提高。

  

图3 差异表达基因统计Fig.3 Statistics of differentially expressed genes注：a.样品间显著差异表达基因数目统计。CK表示对照组、Db1表示低剂量组、Db2表示高剂量组； b. 低剂量组相对对照组基因表达火山图,图中每个点代表一个基因； c.高剂量组相对对照组基因表达火山图。Note：a. Statistics of DEGs between groups. CK represent negative control group, Db1 represent low-dose group, and Db2 represent high-dose group; b. Volcano plot of DEGs between control group and low-dose group. Every dot represent a gene; c. Volcano plot of DEGs between control group and high-dose group.

为了更加清楚地了解这些差异表达基因的功能，进一步对其进行GO富集分析和KEGG富集分析。从图4a、图4b的差异表达基因GO富集图可以看出，在低剂量辐射条件下存在差异表达的基因显著富集于生化过程(Biological Process, BP)类别里的几丁质代谢过程、RNA聚合酶II启动子转录调节、细胞过程等，以及细胞组分(Cellular Component, CC)类别的细胞核、胞外区、胞质小核糖体亚基、突触后膜等，还有分子功能(Molecular Function, MF)类别中的DNA结合、核糖体结构、乙酰胆碱激活的阳离子通道、转录因子活性、转录抑制子活性等。而在高剂量辐射条件下，差异表达的基因更多地富集于生化过程类别中的翻译终止、无义介导的RNA衰减、转录、细胞过程、几丁质代谢过程等，以及细胞组分类别中的胞质小核糖体亚基和胞外区，还有分子功能类别中的神经递质活性、转录抑制子活性、表皮结构、转录因子活性、几丁质结合、序列特异的DNA结合、Poly(A) RNA结合、核糖体结构等。其中表达量上调最多几个的基因包括RNA结合蛋白Nova-1、Ablim2等与基因表达调控功能相关的基因，表达量下调程度最高的基因包括编码内角质层结构糖蛋白ABD-5-like、胶原蛋白、WLS等细胞结构相关的基因。

  

图4 差异表达基因GO富集分析和KEGG信号通路富集分析Fig.4 Gene ontology enrichment and KEGG pathway enrichment of differentially expressed genes注：a-b：带 * 为显著富集的GO Term； c-d：圆点的大小表示该信号通路中显著差异基因的个数，数量越多点越大。 Note：a-b：Asterisk(*) indicated GO terms that were significantly enriched into by DEGs; c-d： The size of the red dot represented the number of DEGs that enriched to the pathway.

KEGG富集分析的结果与GO富集分析结果基本一致，低剂量组的差异表达基因富集在在RNA聚合酶、细胞粘附分子、癌症相关通路、癌症蛋白多糖、轴突导向等通路上，而高剂量组的差异表达基因富集在核糖体、癌症蛋白多糖、Rap1信号通路、造血、细胞粘附分子等(图4c、d)。

3 结论与讨论

本研究通过将新菠萝灰粉蚧这一检疫性害虫暴露在不同剂量的辐射环境下，观察其基因表达的变化与辐照强度的关系。使用两种不同的剂量对新菠萝灰粉蚧进行辐照处理的结果表明，尽管只有不到5%基因在辐照处理后发生了差异表达，但在这些产生差异表达基因里面有50%以上在不同剂量处理条件下都产生了表达差异，说明受辐照处理影响的基因类型是固定的。而在高剂量辐照条件下基因表达较低剂量辐照后的表达水平相对对照组的差异更大，发生差异表达的基因更多，说明辐照的强度越高，受影响的基因越多，对生物功能的影响更广，因而受到的损伤也就越大。可见辐照强度对害虫的影响呈明显的正相关趋势。而过量的辐射不仅能耗大也可能导致产品本身质量收到损害，因此找到有效灭杀害虫和保证货物品质两个主要目的之间的平衡点是检疫辐照处理技术应用的关键步骤。

在对进出口贸易的货物进行检疫辐照处理时，对于某一类的检疫性物种通常采用一个通用剂量。如对于实蝇科Tephritidae物种采用的辐照剂量通常为150 Gy(Bustos et al., 2004)；对于鳞翅目Lepidoptera物种的成虫和蛹通常用到的辐射剂量则为400 Gy，而幼虫和卵则一般使用250 Gy(United State Department of Agriculture, 2016)；对象鼻虫类生物通常采用150 Gy剂量(Obra et al., 2014)；而对于粉蚧类生物的检疫辐照处理一般采用的辐射剂量是250 Gy(Jacobsen and Hara, 2003)。国际原子能机构的国际昆虫灭杀和不育数据库(InternationaInternational Database on Insect Disinfestation and Sterilization，IDIDAS)目前总共收录了针对368种昆虫的成虫、蛹、幼虫和卵等4种状态相应的致死或绝育所需的辐照剂量。

Gulston M, Fulford J, Jenner T,et al. Clustered DNA damage induced by γ radiation in human fibroblasts (HF19), hamster (V79-4) cells and plasmid DNA is revealed as Fpg and Nth sensitive sites[J]. Nucleic Acids Res., 2002, 30(15):3464-3472.

吴滨告诉我，严格意义里的设计从来都不是一味修改或刻意迎合，设计就像一面镜子，能将设计者的内心世界完美的反射在其作品中，所以在全新一代路虎发现中我们能看到路虎全球设计总监哲芮勋的良苦用心。就像汽车范畴里的新车不能一味重塑经典或者一味追逐时尚一样，如何取舍或者兼融既能够体现设计师的功底，也能让人们在优秀的设计面前懂得欣赏和选择，这其实才是设计的魅力所在。这个世界上其实并不存在什么被所有人都喜欢的事物，就像我们平日里在购物时出现的那些爆款商品一样，短短的风靡一时过后必将因为过分的雷同而随即遭受抛弃。

目前检疫辐照主要是使对象不能完成正常的世代或不育来实现检疫处理的目的。本文在基因表达水平观察到差异表达的基因主要富集于细胞核、胞外区、胞质小核糖体亚基等细胞组分功能相关基因和翻译终止、无义介导的RNA衰减、转录等基因表达功能相关的基因，且发生差异表达的基因里面有60%以上都发生了下调。在这些存在差异表达的基因里，上调程度最高的几个基因如RNA结合蛋白Nova-1、Ablim2等与基因表达调控功能相关，而下调程度最高的几个基因如编码内角质层结构糖蛋白ABD-5-like、胶原蛋白、WLS等，则主要与细胞结构功能相关。说明辐照处理对对象的影响主要通过损伤细胞结构和抑制正常基因的表达来实现。而尽管辐照对体细胞和生殖细胞都会产生一定的伤害，关于昆虫的辐照不育机制的研究主要集中关注辐照处理对生殖细胞的影响。体细胞相对于生殖细胞在收到辐射后细胞结构收到的破坏不那么明显，所以通常仍能存活且可以交配，但生殖细胞收到的结构破坏则较为严重，因而交配后产生的受精卵并不能正常发育。如对粗脚粉螨Acarus siro Linnaeus进行γ射线辐照可导致其性原细胞内质网的的膨胀和线粒体嵴的瓦解、在线粒体基质中产生髓磷脂结构等结构损伤，进而破坏精子发生的过程，减少精子细胞的产生(Szlendak et al., 1992)。

本研究通过对新菠萝灰粉蚧进行不同剂量的辐照处理，发现辐照强度和基因表达受影响程度的呈正相关关系，且辐照处理主要影响的基因富集于细胞组分和基因表达过程等功能相关。而受辐照处理后产生差异表达的基因大多下调，说明辐照处理的主要作用机制是使实验对象产生细胞损伤以及正常的基因表达功能收到抑制而导致死亡或者不育，从而实现检疫处理的目的。

参考文献(References)

要探究辐照处理的分子机制，首先要观察具体是哪些基因的表达受到辐照处理的影响，进而推断可能受到辐照影响的生物功能和信号通路，为进一步筛选具体的分子标记提供依据。本研究以不同辐射剂量条件下差异表达的基因的FPKM值为表达水平，用R工具包中的pheatmap软件包进行层次聚类分析(hierarchical clustering)，从而判断在不同辐射剂量下基因的表达模式。聚类层次分析结果显示在两种不同辐射条件下，新菠萝灰粉蚧的基因表达模式差异明显，除了少量特别保守的高表达基因如ACTB、GAPDH外，高剂量组的基因表达模式显得更加紊乱，存在差异表达的基因更多，特别是发生显著上调的基因在高剂量组的差异表达基因总数所占比例约为40%，而在低剂量组中这一比例仅为24%左右。但即使是发生显著下调的基因所占高剂量组差异表达基因总体的比例相对低剂量组要低，但是绝对数量上高剂量组仍然高于低剂量组。说明辐射强度与基因表达的影响呈正比。

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图8给出了本文模型预测的关系与45#钢弹正撞击混凝土靶板实验数据[9]的比较，可以看出:模型预测R/r0的值略高于实验结果，这是由于弹体在侵彻混凝土半无限靶板时，弹头附近的材料由于摩擦的作用容易被磨蚀或烧蚀，从而造成弹体半径减小，所以回收得到弹体的弹头直径相较于侵彻过程中更小。为简化计算，此处暂时忽略这些影响。

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为此，本文提出了采用零损耗深度限流技术提高变压器抗短路能力的方法，首先，分析了零损耗深度限流装置的基本工作原理，探讨了变压器故障类型；其次，分析了变压器抗短路冲击能力下降的原因，得出了采用零损耗深度限流技术可以变向提高变压器抗短路能力的结论；最后，在上述研究的基础上，提出基于零损耗深度限流技术提高变压器抗短路能力的基本应用原则，并通过算例验证该方法的可行性。

重金属矿业废弃地“原位基质改良+直接植被技术”，克服了传统治理方法的不足，并且无需覆土，不会因取土造成二次环境破坏，植被系统稳定不退化，能够显著控制矿山土壤酸化，降低重金属溶出迁移，是一种极具创新性的修复技术。适用于包括排土场、尾矿库、采坑边坡、污染退化土地等在内的矿业废弃地重金属污染修复，从源头控制重金属污染。该方法操作简单、经济有效，可一并解决地质灾害、重金属环境污染、生态恢复三大问题，成本约为传统修复技术的一半，综合成本每平方米单价约90～150元。

Szlendak E,Boczek J, Oliver JH. Effects of radiation on spermatogenesis in Acarus siro L. (Acari: Acaridae)[J]. J. Econ. Entomol., 1992, 85(1): 162-167.

近年来运用DC检测评价人体迷走神经功能成为学者们关注的热点，它最早是由德国慕尼黑心脏中心Georg Schmidt教授提出的新技术[13]。DC检测是在动态心电图基础上，通过数字化自动处理系统描绘出以心动周期RR值为纵坐标的序列图，可以单独、直接、定量地测定迷走神经功能的强度，且敏感性高、特异性强，不易受外界其他因素干扰，克服了HRV存在的缺陷，具有广阔的临床应用前景[14]。

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