三聚氰胺（Melamine，简称Mel）是一种三嗪类含氮杂化的化合物，主要用于胶水、塑料、涂料、厨房用具产品、阻燃剂等工业产品，其含氮量（66.6%）高于蛋白质的平均含氮量（16%）.由于食品工业一般采用凯氏定氮法检测食品含氮量，并进而推算蛋白质含量，所以往食品中添加三聚氰胺会导致蛋白质含量虚高，制造出优质食品的假象.而三聚氰胺一旦通过饮食进入人体，会与尿酸生成结石，含有三聚氰胺的奶粉会导致婴儿生病甚至死亡[1].中国规定婴儿食品中的三聚氰胺不得超过1ppm，因此，发展高灵敏性、特异性强的新型三聚氰胺检测方法在食品安全、环境监测、临床诊断上具有重要的广泛的实际应用价值.

液相色谱—质谱[2]、高效液相色谱—紫外[3]、气象色谱—质谱[4]、酶联免疫分析法[5]是实验室中检测食品中三聚氰胺的典型方法.但这些方法需要很长时间进行前期准备，而且需要高度训练过的操作者用昂贵的仪器进行检测，使得这些方法的推广受阻.而电化学方法具有灵敏度高、准确性好、检测限低、廉价等优点，被用于各种生物分子[6-7]、环境污染物[8]和食品添加剂[9-10]的检测.近年针对Mel分子结构特征和物化属性，多项电化学技术被应用于Mel的电化学检测[11-12].而另一方面，核酸适体化学研究表明，富含胸腺嘧啶的寡聚核苷酸（TRO）可以与Mel通过氢键形成T-Mel-T结构，从而诱导TRO序列折叠成双链结构[13].基于此，一系列基于TRO序列的Mel光谱和电化学传感器被开发和应用.比如，欧丽娟等[13]基于T-Mel-T结构设计了一种三聚氰胺传感器，其原理是TRO遇到Mel形成折叠的双链结构，然后SYBR Green I嵌入折叠结构的DNA中，并释放荧光，且荧光信号相比于单链DNA强度更大.Caili Fu[14]等人基于T-Mel-T结构构建了灵敏的三聚氰胺传感器，在有三聚氰胺分子存在下，两条DNA能部分的形成双链，然后两条链余下的未成链部分与带有亚甲蓝标记物的第三条DNA成链.在外剪切酶的作用下，第三条DNA的双链部分被剪切，亚甲蓝标记物被吸附到ITO电极上，从而检测到电化学信号.

(3)提升机升(降)至取任务1节点所在层，该层穿梭车执行第一个待取货物的出库任务，将其运送至提升机上。

电化学阻抗谱（EIS）技术是一种普遍用于研究溶液和电极界面特性的电化学方法.电极表面修饰材料的微小结构变化均能反映在EIS上，因此EIS常常用于监测分子构型构象的变化[15].此外，EIS的信号通常不依赖于有电氧化还原活性的标记物.因此能以简单的方法实现高的检测灵敏性并且检测的目标物范围较大.基于以上信息，我们构建了一种Mel诱导TRO在电极表面发生构象折叠，并结合高灵敏阻抗检测技术的电化学传感器用于Mel的分析.结果表明，该传感器可在10.0 pM到1.0 μM范围对Mel进行检测，且检测限达到1.2 pM.同时，该传感器显示出优秀的选择性，可用于实际牛奶样品中Mel的检测.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

K4[Fe(CN)6]，K3[Fe(CN)6]，H3PO4，NaCl，MgCl2·6H2O，98%H2SO4，30%H2O2，无水乙醇均购自西陇化工厂股份有限公司；6-巯基己醇，sigma-Aldrich中国有限公司.三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,Sigma-Aldrich中国有限公司);三聚氰胺(上海沪试实验器材股份有限公司).本实验的化学药品均为分析纯，用水均为Milli Q超纯水系统制备（Millipore公司，美国）.

TRO购自生工生物工程（上海）股份有限公司，具体序列如下：

5’-SH-(CH2)6-TCTTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTTGT-3’;

基于市场营销模式下，虽然有很多企业开始重视经济管理，完善经济管理的模式，但是目前有很多企业依然存在着一些问题，需要引起企业自身的重视和处理，这些问题主要表现在以下几个方面。

DNA 固定液为 IB 缓冲液[16]（25.0 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，0.1 M MgCl2，10.0 mM TCEP，pH 8.0）.用固定液将TRO配制成10 μM储备液,置于-20℃下冷冻保存.电化学检测液由1 mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 M KCl组成.三聚氰胺（Mel）以超纯水配制.

CHI 6403E电化学工作站为中国上海辰华仪器公司出产，三电极系统:金电极(AuE)是工作电极，直径2 mm；以Ag/AgCl(3 M KCl)电极作为参比电极；以铂柱电极（Pt）作为辅助电极.安捷伦1200 HPLC/6320 Ion Trap MS高效液相色谱-质谱仪（美国）.Brukers Multimode-8原子力显微镜 (美国).KQ5200DE型超声波清洗器是昆山市超声仪器有限公司出产（中国）.

1.2 DNA的固定

将处理后的金电极AuE放在0.1 μM TRO中于4℃浸泡12 h，用-SH基团将TRO固定在金电极表面.用超纯水淋洗去金电极表面未组装的TRO，得到TRO自组装的修饰电极TRO/AuE.洗净后将TRO/AuE浸入1 mM MCH中于室温下反应1 h，封闭电极表面空余位点，得到修饰电极TRO-MCH/AuE.

将金电极AuE依次用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3抛光粉打磨，打磨干净后依次用超纯水、乙醇溶液（V醇：V 水=1:1）、超纯水超声清洗5min，洗净后将电极放在新配制的Pirahna洗液中（V98%H2SO4:V30%H2O2=7：3)浸泡25 min，将浸泡后的电极再次洗净，在0.5 M硫酸中进行循环伏安法扫描，电位区间在-0.2～1.5 V，扫速是100 mV/s，总共扫描50圈，直至电极稳定.用500 ml超纯水清洗电极的表面，洗后用高纯氮气吹干[16].

1.3 三聚氰胺（Mel）的结合与检测

将修饰好的TRO-MCH/AuE浸入1.0 μM Mel中富集35 min，然后浸泡于含有10 mM NaCl的20 mM PBS(pH 7.0)缓冲液中,洗脱20 min,除去非特异性吸附吸附的Mel，得到Mel修饰电极，记为Mel/TROMCH/AuE.

以1 mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 M KCl混合液作为表征液，对电极现场自组装的过程进行循环伏安（CV）和电化学阻抗谱（EIS）表征.CV电位区间 -0.2～0.6 V；扫速100 mV/s；采样间隔1 mV；静置时间2 s.电化学阻抗谱谱（EIS）频率范围为105～0.01 Hz，振幅0.005 V；静置时间2 s.

2 结果与讨论

2.1 传感器构建的思路及工作原理

由此来看，在古希腊，音乐与哲学都属于一个系列，也就是都关注于理念的世界。两者都以实现美的理念为主旨，而美是理念中最显现的，是宇宙的表现，是与神的关联。这样，只是凭借音乐是不够的，而哲学包罗万象，把音乐也纳入自身之中，哲学由此成为最成功的形式。尽管，现代音乐作品已经与古希腊音乐概念相距甚远，但我们在回顾希腊文明对音乐的认识，理解希腊时期音乐与缪斯相等同的基本思想，注意音乐表现了宇宙统一的秩序、美的秩序这个基本特征的时候，就让我们现代人在如何理解音乐自身的意义和音乐作品的特点、以及音乐与哲学的关系等方面，必定会有所体悟。

  

图1 基于TRO的三聚氰胺阻抗传感器的工作原理

2.2 AFM表征

为了探索TRO传感界面识别Mel的可行性，采用AFM研究TRO的自组装及其与Mel的反应.图2是不同修饰电极的典型俯视图（a）、3D图（b）、截面图（c）.可以看出裸电极（图2A）的表面相对平滑.最大峰高和平均粗糙度分别为48.0 nm和11.7 nm.在电极表面固定TRO以后，平滑的表面变粗糙，并有大量的峰形成（图2B）.最大峰高和平均粗糙度分别达到51.7 nm和15.0 nm.说明TRO已经成功地固定在电极表面.然而当构建的传感器和Mel充分反应以后，传感器表面变平滑一些了（图2C），而最大峰高和平均粗糙度分别降至51.1 nm和13.8 nm.这些变化均表明Mel已经成功与TRO反应，并改变了TRO的构象.

A 短暂的抑郁很快就能走出。有些一过性的情绪不佳，经过心理疏导与自我调适，或号啕一哭，或登山一呼，或三五良友一聚，很快就可以过去了，往往数日就可以恢复正常。

  

图2 裸电极 AuE（A）、TRO-MCH/AuE（B）、Mel/TRO-MCH/AuE（C）的 AFM 俯视图（a）、三维 3D 图（b）、截面图（c）

2.3 电化学表征

本方法将TRO用S-Au键固定在电极表面后,用电化学阻抗谱法,成功地实现了对三聚氰胺的检测.实验结果表明,该传感器显示了良好的识别能力,在10.0 pM～1.0 μM浓度范围内能对三聚氰胺进行定量分析.该方法突破了传统方法操作复杂、前处理繁琐耗时、仪器昂贵的的局限，将TRO探针和阻抗法结合，节约了实验时间和成本，实现了较高的效费比.

  

图3 裸电极 AuE(a)、TRO/AuE(b)、 TRO-MCH/AuE(c)和 Mel/TRO-MCH/AuE（d）在 1.0 mM[Fe(CN)6]3-/4-和 0.1 M KCl混合溶液中的循环伏安图(A)及电化学阻抗谱Nyquist图(B)（Mel浓度1.0 μM）

电化学阻抗谱法（EIS）作为一种超灵敏的界面化学检测技术，能探查到电极与溶液之间界面性质变化的重要信息[21].图3B为铁氰离子和亚铁氰离子在裸电极AuE（a）,TRO/AuE修饰电极（b）、TRO-MCH/AuE修饰电极（c）和Mel/TRO-MCH/AuE修饰电极（d）上的电化学阻抗谱Nyquist图.从图3B Nyquist图上的曲线半圆部分可以获知：裸电极AuE的阻抗是463 Ω；TRO/AuE修饰电极的阻抗是2.6 kΩ；TRO-MCH/AuE修饰电极的阻抗是4.3 kΩ；Mel/TRO-MCH/AuE修饰电极的阻抗是10.6 kΩ.由图3B可知,在界面自组装过程中,电荷转移阻抗值所对应的Nyquist图的高频区半圆的半径逐步增大,说明铁氰离子和亚铁氰离子在电极界面上进行电子迁移的阻力在逐渐变大,这个结论与体系循环伏安图的表征结果相一致.鉴于电化学阻抗谱（EIS）的差值变化远大于循环伏安（CV）图上的差值变化，所以选择电化学阻抗谱（EIS）作为后续分析的主要技术.

2.4 实验条件优化

2.4.1 TRO浓度的优化

选择不同浓度的TRO浸泡裸电极（AuE）12 h，Mel浓度固定为1.0 μM,考察TRO浓度（CTRO）和Mel结合前后电化学阻抗谱（EIS）差值（ΔRct）间的关系，结果如图4所示.从曲线可以看出，随着TRO浓度的增大，实验的电化学阻抗谱差值逐渐增加，表明增大TRO固定浓度能够增加传感器对Mel的捕捉能力.当TRO浓度达到0.1 μM时，ΔRct达到最大值，并随着TRO固定浓度的进一步增大，ΔRct又有所降低，这可能是因为电极表面太高的TRO固定密度，会增大传感界面对Mel结合的空间位阻，从而降低传感响应性能.因而本实验选择0.1 μM作为TRO最佳的固定浓度用于传感器的构建.

  

图4 ΔRct与TRO浓度(CTRO)关系曲线（Mel浸泡时间35 min，检测液为0.1 M KCl+1.0 mM[Fe(CN)6]3-/4-）

2.4.2 TRO-Mel相互反应时间的优化

将TRO-MCH/AuE浸入1.0 μM的Mel溶液考察TRO-Mel相互反应的时间（t）对阻抗（Rct）的影响，结果如图5所示.从曲线上可以看出来，随着浸泡Mel的时间的延长，电化学阻抗谱的Rct值先是增加，说明TRO结合Mel的量一直在增加；然后当浸泡时间到达15 min时，Rct基本趋于稳定，证明TRO和Mel的结合达到饱和.因此本实验选取15 min作为两者反应时间的优化结果.

  

图5 Rct与TRO和Mel相互作用时间（tMel）的相互关系（TRO的浓度为0.1 μM，浸泡时间12 h，检测液为0.1 M KCl+1.0 mM[Fe(CN)6]3-/4-）

2.5 分析应用

2.5.1 线性分析

[6]Laurila T,Sainio S,Caro M A.Hybrid carbon based nanomaterials for electrochemical detection of biomolecules[J].Progress in Materials Science,2017,88:499-594.

叶总和钱总相视一笑，继续说道：“其实你那一整袋子玉都是宝贝，你现在手里拿着的那个玉坠，卖到我店里，我出价不会低于5万。要按你的说法，你有这么一袋子，那确实是价值连城啊。”

 

相关系数R2=0.9968(图6B).根据3倍信噪比原则，计算得该传感器检测限为1.2 pM.

  

图6 线性图6A(a:空白;b:10.0 pM;c:0.10 nM;d:1.0 nM;e:10.0 nM;f:0.10 μM;g:1.0 μM)和图6B电化学阻抗谱差值（ΔRct）与Mel浓度对数（Log CMel）的线性关系图，检测液为0.1 M KCl+1.0 mM[Fe(CN6]3-/4-）

2.5.2 传感器的选择性研究

为了考察传感器的抗干扰能力，我们进一步研究了共存物质对传感器检测性能的影响.图7展示了传感器分别与空白液、 空白+0.1 μM Mel、10 μM 干扰物质、10 μM 干扰物质+0.1 μM Mel的反应结果.从图7可以看出，相比于空白溶液，Mel出现时的ΔRct变化很大.但是当氨水、半胱氨酸、尿素、L-苯丙氨酸、牛血清白蛋白、葡萄糖、氯化钠的浓度分别为Mel的100倍时，阻抗差值ΔRct的变化最高只有6.4%.这表明即使干扰物质以100倍于Mel的浓度和Mel共存，传感器仍然对Mel表现出优异的检测性能.

推动国企实质性混改，相关部门要尽量减少行政化的指挥和干预。一家地方重点国企董事长告诉记者，企业十年前就上市了，后来还引进了战略投资者，从成分上看是不折不扣的混合所有制企业。不过，“企业仍和以前一样，经常收到上级部门的红头文件，要求参照执行。”

  

图7 干扰物质影响图（TRO 浓度 0.1 μM，浸泡空白、空白+0.1 μM Mel、10.0 μM 干扰物质、10.0 μM干扰物质+0.1 μM Mel的时间均为16 min，检测液为0.1 M KCl+1.0 mM[Fe(CN)6]3-/4-）

2.6 实际样品检测

为了验证所构建传感器的实用性，使用牛奶样品（来自漳州市面上的某两个品牌罐装纯牛奶），根据文献[17]中的方法，将5 g牛奶加入0.75 g NaCl，超声10 min，然后密闭，在100℃下保持10 min，冷却，离心机10000 R/min，离心10 min，上层清液用0.22 μm聚四氟乙烯膜过滤.最后，取滤液稀释后用于检测三聚氰胺.对于牛奶样品，两份样品用两种方法均未检测出Mel，于是使用标准添加法研究传感器的准确性，回收率在96.4%～104.4%，如表1.这表明用该电化学方法在食品样品中检测三聚氰胺的的可靠性.

 

表1 运用本方法和HPLC-MS检测牛奶中的三聚氰胺含量

  

样品 本法检测 HPLC-MS检测 加标量 本方法检测结果 加标回收率牛奶样品1牛奶样品2 0 0 0 0 25.0 nM （24.1±2.1）nM 96.4%2.50 nM （2.61±0.24）nM 104.4%

3 结论

TRO与Mel反应，使TRO构象发生改变，从而导致CV和EIS的信号发生变化.图3A为用循环伏安法对裸 Au 电极(a),TRO/AuE(b)TRO-MCH/AuE(c)和 Mel/TRO-MCH/AuE（d）在 1.0 mM[Fe(CN)6]3-/4-和 0.1 M KCl中的进行表征的结果图.在裸电极AuE图上有一对图形对称的[Fe(CN)6]3-/4-的电氧化还原峰,其氧化峰电位(Epa)为+0.239 V，还原峰电位(Epc)为+0.164 V,峰电位差为 75 mV(曲线 a)，峰电流之比 Ipa/Ipc≈1，这表明打磨后的裸金电极具有较好的导电性.当TRO自组装固定在电极上后,由于DNA磷酸骨架显电负性与[Fe(CN)6]3-/4-存在静电互斥作用,导致三价铁氰离子和四价亚铁氰离子在电极表面上的扩散受阻,所得的氧化峰和还原峰电流值显著降低,峰电位差迅速增大(曲线b)；当MCH组装到电极表面，封闭了空余位点后，峰电流进一步降低(曲线c)；而当传感器与1.0 μM Mel反应后，体系的峰电流降至最低，整个曲线基本没有峰电流(曲线d)，证明TRO已经和Mel发生反应.同时由于Mel并非电活性物质，而且TRO弯曲后空间位阻增大，二者均阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面上的电子迁移，导致CV的电流降低.

图1为传感器的构建思路及工作原理.首先将富T碱基寡聚核苷酸TRO通过S-Au键以自组装方式固定在金电极表面，然后通过浸泡将MCH固定在金电极表面，以获得MCH和TRO的混合层.这个步骤阻止了非特异性吸附的Mel分子占据金电极的空余位点.在这样一个传感界面上，电极表面固定了大量TRO，使得电化学探针Fe(CN)63-/4-较难扩散到电极表面，导致EIS值增大.一旦Mel加入到分析溶液里面，TRO中T碱基与Mel通过氢键形成T-Mel-T结构，诱导TRO形成U形结构，这样进一步增大了[Fe(CN)6]3-/4-探针在电极表面扩散的空间位阻，从而使EIS中的电化学阻抗信号值再次上升.因此，通过测量与Mel反应前后的EIS信号差值，即可检测Mel浓度.

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在网络平台上设置一个资源拓展库，包括每个知识点和相关拓展知识，学生可以在课前或课后进行观看和学习。教师也可以在课程教学中穿插课外拓展知识，以达到知识迁移的目的。

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将TRO-MCH/AuE修饰电极与不同浓度Mel进行反应,考察传感器检测灵敏程度.结果表明,随着Mel浓度的不断增大,阻抗值逐渐变大 (图6A).表明随着Mel浓度的提高,电极表面的Mel结合率不断增大,TRO直链形结构转化成U形结构的比例也不断提高,空间位阻不断增大，另外，Mel本身不是电活性分子，两重因素叠加从而导致电化学阻抗谱不断增大.将电化学阻抗谱差值（ΔRct）与Mel浓度对数(lgCMel)作图,结果发现ΔRct与lgCMel在10.0 pM～1.0 μM浓度范围内呈良好的线性关系,其线性方程为

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查《张家口市水文水资源手册》附图5-4～5-9，于流域重心分别查出不同历时的暴雨量均值和变差系数Cv值，取3.5Cv，据此求得10年、30年一遇设计点雨量，成果如表1，不同标准不同历时面雨量，成果如表2。

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《华盛顿共识》在全球的盛行，的确有着当时的时代背景:前苏联体系的瓦解、信息技术的兴起和以金融自由化为主的经济全球化的发展，这些现象都成了强调效率优先的新古典经济学兴起的现实支撑。然而，问题的关键是我们如何去认识新古典经济学的实质，是将它作为周期性的现象看待，还是作为趋势性的现象看待。显然，《华盛顿共识》是将它作为趋势性的现象看待的，试图将这一方案作为一般性的方案向全球推广。然而从今天的情况来看，《华盛顿共识》不仅在发展中国家的实践效果不甚理想;而且，在2008年全球经济危机之后，随着贸易保护主义和逆全球化势力的抬头，西方国家的宏观经济政策也与新古典经济学倡导的政策渐行渐远。

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马克思的矛盾观点就是在激烈地解构黑格尔唯心矛盾观的基础上生成的。马克思认为黑格尔的矛盾观的最大错误就在于它的唯心性，并指出“理性一旦把自己设定为正题，这个正题、这个与自己相对立的思想就会分为两个互相矛盾的思想，即肯定和否定，‘是’和‘否’。这两个包含在反题中的对抗因素的斗争，形成辩证运动。”［1］140也就是说，用思辨来解决现实矛盾，只会带来无限循环的纠结与迷途。