近年来，肠道微生物群与人类健康相关的研究层出不穷，已成为微生物研究的一大热点。FAO/WHO将益生菌定义为在适量运用的前提下，活的能够调节菌群达到平衡状态并有益于宿主健康的微生物[1]。

双歧杆菌是益生菌的典型代表，在婴儿期广泛定值于人类肠道中，可以刺激系统性及肠道局部免疫系统，促进TH1 / TH2达到平衡状态[2]。不同的菌株可以促进不同疾病的治疗和恢复，如在过敏、乳糜泻、感染性肠炎、坏死性肠炎等疾病的治疗中都取得不错的疗效[3]。也有研究发现双歧杆菌的组成、多样性以及相对丰度发生变化后可能导致某些疾病的发生如肥胖[4]。

到目前为止，已经发现双歧杆菌属有48个类群分属6个不同的系统发育组，[5-6]，比较基因组学分析发现，两歧双歧杆菌含有参与粘蛋白分解的高度保守的预测基因序列[7]，它在生长代谢过程中可以分泌一种胞外多糖[8-9]。两歧双歧杆菌在肠道中的量随着成年人年龄的增长而逐渐减少[4]，因此，我们希望通过检测小鼠粪便中两歧双歧杆菌ATCC 29521的量来了解其在肠道中的定植情况。

从决策阶段、设计阶段、施工阶段及运营阶段的建设工程全寿命周期的角度，构建与工程管理类本科课程体系相匹配的案例库[6]，并开展多种形式的信息化教学活动，如蓝墨云班课、雨课堂、慕课（MOOC）等进行案例教学，同时通过互联网实现大数据记录对教育和学习行为进行高效管理，将教学形式由课上延展到课下，实现学生即时自主学习、师生即时互动，形成以分析解决真实案例为主体的考核方式[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2.3 粪便总DNA提取 粪便每个样品取200 mg，按照QIAGEN粪便基因组DNA试剂盒说明书提取总DNA。

3.1.3细长纺锤形应用于矮砧密植园。定植当年，如果选用3年生大苗，定植时尽可能少修剪。不定干或轻打头，仅去除直径超过主干干径1/3的小主枝。如果用2年生的苗木，在1.0～1.2米饱满芽处定干。萌芽后严格控制主枝生长势，一般新梢长度达到25～30厘米时进行拉枝，角度90～110度，培养强健的中心干，中心干上培养18～25个小型化主枝(粗度小于分枝处1/3干径)，整形完成后树高控制在3.5～4.0米。

1.2.4 引物序列的设计 依据B.bi fi dum ATCC 29521 16S rRNA基因序列应用Premier 5. 0设计特异性PCR引物，使RT-PCR产物片段包含在PCR产物片段内（表1）：

经验模态分解方法假设所有信号都是由若干个固有模态函数(intrinsic modefunction，IMF)和一个残余量(residual volume，RV)组成，其中IMF满足以下两个条件：1)信号的极值点个数与过零点个数之差必须等于或小于1；2)信号的上、下包络线的均值为0。通过经验模态分解，任何信号s都可以表示为

1.2 方法

1.2.1 养菌及集菌 B.bi fi dum ATCC 29521复苏后，在加入0.05% L-半胱氨酸及其盐酸盐的MRS液体培养基并置于厌氧灌中培养24 h，倍比稀释计数后室温下4 500 r/min离心取得菌斑，再用生理盐水洗涤两次，最终用生理盐水配备成混悬液。

1.2.2 实验动物分组及处理 小鼠适应性喂养一周后，随机分为2组，单次灌胃组予1×109CFU（溶于0.5ml生理盐水）灌胃一次，连续灌胃组予1×109CFU每天早上灌胃一次，连续3周。单次灌胃组于灌胃后 0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h收取粪便，连续灌胃组于灌胃前、灌胃1、2、3周后，灌胃停止3 d及1周后（即0、7、14、21、24、28 d）取粪便，并置于-80℃冰箱。

1.1.1 实验动物 SPF级C57BL/6雌性小鼠，8 ～10 周龄，20 ±2 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK（京）2012-0001。饲养于SPF环境，室温（22 ±2）℃，自由进食及饮水。

割台装置采用作物夹持切割的方法将向日葵籽盘和秸秆完全分离，利用软收集装置收集不会对收割后的向日葵籽盘造成机械损伤。

1.1.2 实验菌株及试剂 两歧双歧杆菌（Bi fi dobacterium bifidum，B.bifidum ATCC 29521 American Type Culture Collection, ATCC）。MRS培养基购自北京陆桥公司。10×PCR Buffer，dNTPS，TaqDNA聚合酶均购自TakaRa大连宝生物工程公司； Fast SYBR Green Master Mi×(2×) AB公司；引物设计及测序由上海生工公司完成；细菌基因DNA试剂盒购于北京天根生化公司DNA试剂盒购于德国QIAGEN公司

表1 本研究中所用引物 Table 1 Primers used in this study

Name Primer sequences Amplif i ed fragment B. b-PF CTACGGGAGGCAGCAGTG 675 B. b-PR CGAAGGGAAACGCCATCT B. b-QF CTACGGGAGGCAGCAGTG 111 B. b-QR TTGCTCCCAAACAAAAGA

1.2.5 标准曲线的制作

平常我听到大雷声都要哭的，那一天却没有哭，就像第一次被鹅咬到屁股，意外多过惊慌。最奇异的是，雨虽是那样大，离我和母亲的位置不远，而我们站的地方阳光依然普照，母亲也没有要跑的意思。

1.1.3 主要仪器及设备 厌氧罐，实时定量及普通PCR仪，微量分光光度计，电泳仪及凝胶成像分析系统，-80℃低温冰箱，恒温金属浴等。

（2）标准品的制备 B.bif i dum ATCC 29521加入溶菌酶1 h破壁后，按照天根细菌DNA试剂盒说明书提取DNA，行普通PCR扩增后，送上海生工测序，结果相符。测定DNA浓度，计算拷贝数，按10倍稀释为 107 ～ 103copy/μl为标准品。

（1）PCR及QPCR体系及条件：PCR体系：总量 30 μl, buffer 3 μl，dNTP 2.4 ul，上下游引物（F 0.3 μl，R 0.3 μl），Taq 0.15 μl，模板 5 μl，ddH2O 18.85。扩增条件 ：95℃ 预变性 5 min ；95℃ 变性 40 s，56.6℃ 退火 40 s，72℃ 延伸 50 s，30 个循环 ；最后72℃ 延伸 5 min。实时荧光定量PCR体系：总量 20ul，Fast SYBR Green Master Mi × 10 μl，双歧杆菌属上下游引物（F 0.8 ul ，R 0.8 μl），模板 2 μl，ddH2O 6.4 μl。扩增条件 ：95℃ 预变性 5 min，95℃变性 15 s，,52℃ 退火 10 s，72℃ 延伸 15 s，50 个循环。熔解条件：从 72℃升至 95℃，保持5 s，再降至65℃，保持 1min。

1.2.6 样品检测 按照制作标准曲线的同等条件和体系，将待测粪便DNA样品进行实时荧光定量PCR反应，实验同时设标准品为阳性对照和ddH2O为阴性对照。

2 结 果

2.1 基因组及PCR产物电泳结果 将提取的DNA用微量分光光度计检测，A260/280介于1.8 ～ 1.9之间，粪便DNA组浓度在400 ～ 800 mg/L之间，琼脂糖凝胶电泳检测时，粪便DNA有明显主条带出现；将B.bif i dum DNA作为模板进行普通PCR扩增后，电泳后可见条带清晰，目的片段位置正确（图1）。

图1 不同时间点粪便DNA及B.bif i dum PCR扩增产物电泳结果 Figure 1 Agarose gel electrophoregram of DNA of mice feces and PCR products of B.bif i dum

注：M为DNA Maker，分子量为1 000 bp，CON为阴性对照ddH2O模板，BB1、BB2为双歧杆菌PCR产物2个重复孔。

2.2 标准曲线输出 将已知拷贝数的标准品按照10倍梯度稀释后，行实时荧光定量PCR后可得到其相对应的CT值，以CT值为横坐标，标准品各个稀释度的菌数对数为纵坐标，可得到线性标准曲线，曲线的方程为：y = 0.1835x + 9.0628，相关系数R2为0.9994（图2）。检测样品时将实时荧光定量PCR反应过程中达到荧光阈值所需的初始循环数，代入标准曲线方程中，即得到样品的菌数对数，换算成Ncfu/g即可得知样品中菌数结果。

图2 实时荧光定量PCR标准曲线 Figure 2 Standard Curve of RT-PCR

2.3 单次灌胃组双歧杆菌定量结果 小鼠单次灌服 1×109 CFU 菌液后，于 0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h收取粪便并提取DNA行实时荧光定量PCR检测。整体菌量变化呈先升高后降低趋势，在0 h、灌胃2 h后均未检测到，4h后开始逐渐升高，10h菌量达到最高峰为6.0×107 CFU/g粪便，之后菌量逐渐下降，灌胃12至16 h区间下降幅度最大，24 h后只检测到少量菌体（图3）。

3.在心理维度的测量中，“民营企业关爱员工的方式”和“非工作时间福利的方式”是最重要的两个指标。另外两个指标“对社会文化的发展”和“对生态与人文环境保护”权重较低，说明若民营企业在这些方面表现不好，不会引起强烈不满。

图3 单次灌胃组不同时间点小鼠粪便双歧杆菌菌量变化 Figure 3 B.bifidum numbers in different time points of mice in singal dose group

2.4 连续灌胃组双歧杆菌定量结果 连续灌胃组小鼠每天灌服1×109 CFU菌液，共3周，于0、7、14、21、24、28 d收取粪便。灌胃1周后菌体量达2.0×107 CFU/g，2周后上升至 1.0×108 CFU/g，3周后菌量增加不明显，为1.1×108CFU/g，由此可见灌胃1周内菌体量升高较明显，2周时体内菌体量已经达到平台期，停止灌胃后菌量逐渐下降，停止1周后降至4.8×105 CFU/g，但仍高于灌胃前水平（图4）。

图4 连续灌胃组不同时间点小鼠粪便双歧杆菌菌量变化 Figure 4 B.bif i dum numbers in different time points of mice in successive administration group

3 讨 论

随着16SrRNA、宏基因组测序等新技术的开展，肠道菌群的研究越来越深入，对人类健康的影响也更加受到关注。人们逐渐认识到肠道菌群与宿主之间相互依赖相互影响相互制约，作为体内最大的“器官”，微生物与宿主的消化、免疫以及代谢能力息息相关，也可以说它关乎我们整个健康状态[10]。

双歧杆菌作为传统的生态益生菌菌种，在食品添加及辅助药物中都扮演着重要角色。有研究报道双歧杆菌在多种疾病中减少，包括2型糖尿病[11-12]、炎症性肠病[13]、结肠癌[14]等。同时，双歧杆菌具有纠正肠道菌群紊乱、生物拮抗和免疫调节等功能。其中双歧杆菌对炎症性肠病的作用更是广为报道，Wei等[15]发现α-MSH与双歧杆菌结合后其分泌能力及活性未改变，双歧杆菌可作为媒介携带MSH到肠道中预防IBD的复发，产生抗炎作用。两歧双歧杆菌可以促进宿主后天免疫系统的进化及成熟[16]，如两歧双歧杆菌 Z9可以调节小鼠树突状细胞的相关基因表达[17]。也有研究发现两歧双歧杆菌ATCC 29521可以调节小鼠肠道菌群，有选择性地增加某些菌如乳酸菌的增植同时打击某些菌的定植，可以促进益生菌生长同时抑制病原菌繁殖[18]。因此两歧双歧杆菌对于临床疾病的治疗作用仍有待于开发及验证，而了解它在体内的定植情况可以帮助指导临床用药。

尽管测序技术可以检测到很多无法通过普通培养得到的细菌，但是在某个菌株的定量检测上却有限制。而实时荧光定量PCR 因其敏感性高、特异性强、重复性好的特点，被广泛用于微生物研究中，它的主要优势在于可以确定样本中菌种的菌体数量[19-21]。益生菌发挥功效的活细胞数量最低应该保持在1.0 ×106到1.0 ×108CFU/g之间[22]。李让等[23]研究了长双歧杆菌BBMN68在大鼠胃肠道中的分布情况，大鼠灌服菌液后，检测大鼠胃、小肠、结肠、直肠不同部位内容物的菌体含量，发现结肠、直肠中的活菌量最多且双歧杆菌在结肠中会增殖，直肠内容物在灌胃后12 h达到高峰，这与本研究的结论相符，我们发现灌服小鼠后10 h左右达到高峰，这可能与小鼠消化道明显较大鼠的短有关，且利用检测粪便中的含量来评估菌体定植情况具有无创伤性、操作方便、依从性好等特点，更适用于以后临床病人的检测评估。连续灌胃组小鼠在第一周内菌体量升高幅度最明显，也就是说刚开始给药时菌体更容易在体内定植，到第2周时达到平台期，这说明菌群的定植可能类似受体效应，当达到一定量时，受体饱和，菌群缺乏位点，则无法继续增殖。因此说明在治疗运用时，两歧双歧杆菌ATCC 29521的给药周期至少需要2周，此后继续增加给药时间不会明显增加体内菌量，体内已经达到定植-排泄平衡状态，但停止灌胃1周后，菌量明显下降，也就是说如果要维持此菌的治疗作用，需要持续给药，使体内的有效菌量维持在平台期。

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