牙周病是指发生在牙齿支持组织(牙周组织)的疾病，其治疗的难点在于牙周软、硬组织的再生和新附着。目前，牙周组织的再生理念已由单纯的引导性充填，更新为利用牙周组织工程技术和基因工程技术使牙周软、硬组织重新附着，而恢复解剖结构和功能。牙周组织工程技术是种子细胞与生物支架材料复合，生长因子诱导其增殖分化，复合体植入至牙周组织缺损部位，引导牙周组织再生，形成新的附着[1-2]。间充质干细胞(MSCs)具有增殖传代能力强、细胞均一性好及可分化成软骨、骨骼、神经、肌腱和肌肉组织等特点，因此作为组织缺损修复的种子细胞逐渐受到重视，其定向分化依赖于细胞生长因子的诱导作用[3]。体外使用生长因子半衰期短，需使用较大剂量的生长因子进行循环刺激，所以成本较高，而基因工程技术将生长因子基因片段导入种子细胞中，使内源性生长因子持续和高生物活性的表达，从而调控种子细胞的增殖分化[4]。转化生长因子-β1(TGF-β1)具有促进细胞外基质的合成和调控骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化为成骨细胞和成软骨细胞的作用[5-6]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以促进未分化的MSCs进行增殖；可以营养神经，使得内皮细胞被激活，加快细胞的进一步分裂，促进血管的生成，对创伤的修复具有促进作用，也有利于组织的再生[7-8]。由此，本实验以脂质体为载体来介导TGF-β1、bFGF基因修饰BMSCs，检测两基因的表达情况，为探究基因工程技术应用于牙周组织再生提供依据。

“认知陷阱”是如此隐蔽，很多时候我们还没意识到，就已经掉进陷阱里了。先识别自己的“认知陷阱”，识别自己的“认知陷阱”是跨越陷阱的第一步，正如在现实生活中，如果我们看见前面有一个坑，会选择跳过去或绕过去一样。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞真核表达载体pcDNA3.1(+)(5427 bp)、克隆载体pMD20-T vector、E.coli DH5α均购自舟山同生生物科技有限公司；RT-PCR试剂盒、高保真聚合酶、PrimeScript TM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒、DNA Marker均购自日本TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；T4连接酶、Hind Ⅲ和XhoⅠ限制性内切核酸酶均购自美国Therom Fisher公司；培养基F12/DMEM、胎牛血清均购自美国Hyclone公司；琼脂糖、胰蛋白胨、琼脂粉、酵母浸出粉、卡那霉素、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；CD29、CD90 FITC荧光单克隆抗体均购自美国BioLegend公司；bFGF、TGF-β1、CD34 PE荧光单克隆抗体、β-actin均购自美国Santa Cruz公司；CD45 PE荧光单克隆抗体购自美国eBioscience公司；TRIZOL、Opti-MEM Medium、脂质体Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司；大鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。紫外分光光度计购自北京市六一仪器厂，型号：WD-9403；电热恒温水温箱购自上海医用恒温设备厂，型号：HH-W21-600；CO2培养箱购自美国赛默飞世尔科技公司，型号：3110；流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司，FACSCalibur；倒置相差显微镜购自重庆光电仪器有限公司，型号：XDS-1B。

1.2 实验动物与人牙龈组织标本采集

选择健康的、4周龄、SPF级SD大鼠20只，体质量60～100 g，由南昌大学实验动物科学部提供。人牙龈组织标本来源于行阻生齿拔除术的患者。本实验经南昌大学第二附属医院医学伦理委员会批准；患者及其家属均对本实验知情同意，并签署知情同意书。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计与合成

根据NCBI数据库收录的人TGF-β1与bFGF基因的mRNA序列(NC_030684.1，NC_000004.12)，使用Primer5.0统计软件展开引物设计。同时在引物上游与下游位置插入Hind Ⅲ和Xho Ⅰ酶切位点及其保护性碱基(下划线所示)。TGF-β1：F为5′-ATCAAGCTTACCATGCCGCCCTCCGGGCT-GCGGCTGCTG-3′，R为5′-ATCCTCGAGTCAG-CTGCACTTGCAGGAGCGCAC-3′(468 bp)；bFG-F：F为5′-ATCAAGCTTACCATGGCAGCCGG-GAGCATCACCACGCTG-3′，R为5′-ATCCTCGAG-TTAGCTCTTAGCAGACATTGGCAG-3′(1173 bp)。

浅谈小型农田水利工程建设管理中常存在的问题及解决措施……………………………………………………… 王银（12-153）

用颈椎脱臼法将SD大鼠处死。然后，用75%乙醇浸泡5 min。在无菌环境下，将双侧股骨分离，将骨表面的软组织去除，通过DMEM/F12培养液对其清洗、浸泡。将位于两端的骨骺剪断，暴露骨髓腔。用5 mL的注射器吸取DMEM/F12培养液，并对骨髓腔反复冲洗，直至骨髓腔变白为止。将冲出的骨髓悬液收集于50 mL的塑料离心管中，再缓慢加入至装有20 mL的大鼠淋巴细胞分离液的 50 mL 的离心管中，20 ℃、800 r·min-1离心20 min。收集分层界面上的有核细胞，用20 mL的PBS稀释，20 ℃、400 r·min-1离心10 min，弃上清。然后，用完全培养基重悬、计数，以2×105 cm-1接种25 cm2培养瓶，加完全培养基10 mL，37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。培养后，首次换液，此后每24 h换液1次。待BMSCs接近融合时，用胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代，以2×103 cm-1密度行第1次接种传代。此后常规培养，待BMSCs生长至80%～100%融合时，以1：3进行传代。在BMSCs培养过程中用倒置相差显微镜观察BMSCs形态的变化及生长、增殖情况，以第3代BMSCs用于实验。

人牙龈组织总RNA采用Trizol法提取，使用紫外分光光度计进行浓度与纯度的检测。检测后，放置-80 ℃ 冰箱中保存，备用。依据反转录说明书将总RNA反转录。然后，进行PCR的扩增。PCR反应条件：63.6 ℃ 5 s，98 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，共30个循环。扩增的tgf.fgfb的产物通过浓度为1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3.3 人TGF-β1与bFGF基因克隆的PCR产物

通过浓度为1%琼脂糖凝胶电泳完成回收纯化。取1 μL的pMD20-Tvector扩增的tgf.fgfb产物，再加入3 μL的灭菌蒸馏水，将其混匀。混匀后，加5 μL的Ligation Mighty Mix，将其混匀。在16 ℃ 温度条件下，持续连接30 min。然后，将回收到的产物向E.coli DH5α感受态导入进行培养，同时将阳性克隆菌落筛选出来。采用Hind Ⅲ、XhoⅠ双酶切完成鉴定后，将其送至上海生工生物工程技术服务公司进行测序。

1.3.4 真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1、pcDNA3.1-bFGF的构建

每个雷达图都是由5个指标组成的三角形，且每个三角形中的一个角度为已知量，可以通过各指标的长度及指标间的角度得到每个三角形的面积，进而得到每个雷达图的面积，见公式(1)；同理周长也可以利用三角函数取得，见公式(2)。

育结束。用0.01 mol·L-1 TBST洗膜3次，ECL化学发光曝光胶片。

1.3.8 RT-PCR检测转染重组BMSCs中TGF-β1、bFGF的表达

灯光亮起，有一队人从后台缓缓地走了出来，为首的一个男人，吊儿郎当地叼着一根烟，不时吐出一个烟圈，后面有的人拿着一把匕首，嘻嘻哈哈地插在自己的身上，又拔出来，那分明是一把道具用的伸缩匕首，有的人用纸巾擦着自己身上、脸上的血迹，而我也慢慢从舞台上爬了起来，冲着那个目瞪口呆的女孩微微一笑，拍了拍身上的土。

1.3.2 总RNA提取及RT-PCR

1.3.7 脂质体转染BMSCs

1.3.6 BMSCs流式细胞仪行表型鉴定

将传至第3代BMSCs吸弃培养基，PBS洗涤BMSCs 2次。加入0.25%胰蛋白酶，室温消化1 min。用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，移液器移至15mL的离心管中，1200 r·min-1离心5 min，弃上清液，用PBS洗涤3次。PBS重悬为单细胞悬液并计数，调整BMSCs浓度为5×105 个·mL-1，依次加入FITC-CD29 5 μL、FITC-CD90 5 μL、PE-CD34 5 μL、PE-CD45 5 μL，每管设立同型对照，4 ℃、5%CO2培养箱孵育30 min，PBS洗涤后重悬，过滤后上机(流式细胞仪)检测并分析。

Study on semicontinuous condensation process of sodium cocoyl-N-methyl taurate 9 17

bFGF、TGF-β1真核表达载体通过脂质体转染至第3代BMSCs，根据Lipofectamine 2000脂质体转染试剂说明书进行转染。

我们就这样在乡里唯一的，也是最繁华的“长安”大街上走着，在目光织成的网中穿过，似乎还听见了窃笑声。我想溜，又没借口，想跑又跑不起来，只好低下头，感到芒刺在背，苦不堪言。我斜眼见她挺着丰满、高耸的胸脯潇洒自若地走着，想和我说什么；我佯装看脚下的路，只看见她一闪一闪，穿着白皮凉鞋的脚尖。

1.3.5 SD大鼠BMSCs的培养

①关于黄河口地域概念的界定因历史上黄河“善淤、善决、善徙”而导致其河口的变迁极为复杂，在研究中一般认为黄河口就是黄河三角洲的代称，但是黄河三角洲按其形成年代分为古代、近代和现代黄河三角洲，出于具体研究的需要，同时因近代黄河三角洲90%以上地域在东营市行政辖区之内，本文在研究中主要以东营市行政区划范围来界定黄河口。

流式细胞仪鉴定结果显示，分离培养的第3代BMSCs的表面抗原CD90、CD29阳性率分别为98.12%、98.23%，而造血干细胞的特异性表面抗原CD34、CD45阳性率分别为0.00%与0.01%，呈阴性表达。见图2—4。

 

表1 TGF-β1、bFGF和β-actin基因的检测引物序列

  

检测引物 引物序列 产物大小bFGF正向引物5'-ATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGC-3'468bpbFGF反向引物5'-TTAGCTCTTAGCAGACATTGGCAGG-3'TGF-β1正向引物5'-CTACCGCTGCTGTGGCTACTGG-3'476bpTGF-β1反向引物5'-TACAGCTCCACGTGCTGCTCCA-3'β-actin正向引物5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'442bpβ-actin反向引物5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'

1.3.9 Western blot检测转染重组BMSCs中TGF-β1、bFGF的表达

待BMSCs生长至70%～80%融合时，每1×107 BMSCs加入1 mL预冷的RAPI蛋白裂解液，提取总蛋白，采用BCA测定法对其进行蛋白定量，样品放置 -70 ℃ 冰箱保存。然后，每孔总蛋白上样量是 50 μg，通过12%Tris-甘氨酸及SDS聚丙烯氨酸进行凝胶电泳。再通过湿转法向PVDF膜上转移，对5%脱脂奶粉进行1 h的封闭，加兔抗鼠多克隆抗体TGF-β1(1:2000)和bFGF(1:1 000)，放置4 ℃ 的电热恒温水温箱孵育过夜。用0.01 mol·L-1TBST洗膜3次，加HRP标记的羊抗兔二抗(1：5000)，37 ℃、5%CO2培养箱孵育1 h，二抗孵

对克隆质粒pMD20-ND2和pcDNA3.1载体用Hind Ⅲ、XhoⅠ双酶切。然后，用回收的双酶切载体链接目的基因用T4的相关连接酶，反应条件是：T为16 ℃、过夜。将连接后得到的产物向E.coli DH5α感受态细胞转化，涂布含抗生素的平板，37 ℃、5%CO2培养箱培养过夜。挑选5个平板克隆，接种于含卡那霉素、氨苄青霉素的培养基中，37 ℃ 摇床培养至培养基浑浊，取1 μL行PCR鉴定。

2 结果

2.1 BMSCs形态学特征

接种当天BMSCs呈小圆形，大量红细胞悬浮于培养液中。24 h后，可见大量贴壁BMSCs，其中可见少量BMSCs呈短棒状。3 d后，贴壁BMSCs呈现多样化的形态，如梭形、短棒状、多角形等(图1A)。5 d后，可见呈辐射状与旋涡状排列的三角形或梭形的BMSCs(图1B)。6～7 d后，BMSCs呈长梭形，增殖迅速，呈融合生长(图1C)。传代后的细胞均匀生长，增殖迅速(图1D)。

 

A：BMSCs原代培养3 d；B：BMSCs原代培养5 d；C：BMSCs原代培养7 d；D：BMSCs传代培养2 d。

图1 不同原代培养时间的BMSCs

2.2 BMSCs的流式细胞仪鉴定

转染大鼠BMSCs 24 h后，提取细胞总RNA。反转录后，根据bFGF和TGF-β1基因设计引物(表1)。采用Trizol法提取重组BMSCs RNA，紫外分光光度计对其浓度与纯度进行检测。然后，放至—80℃的冰箱中保存，备用。按反转录说明书对总RNA进行反转录，同时进行PCR扩增。PCR产物用0.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

  

图2 CD29+CD34

  

图3 CD45+CD90

  

图4 FITC同型+PE同型

2.3 bFGF、TGF-β1基因的扩增

通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示，478 bp的条带和1173 bp的条带与目的基因在大小上大致相同。见图5。

 

M：DM 2000 bp marker;1—2:bFGF、TGF-β1核苷酸系列的扩增产物。

图5 bFGF、TGF-β1核苷酸序列琼脂糖凝胶电泳

2.4 pcDNA3.1(+)-TGF-β1、pcDNA3.1(+)-bFGF表达载体的构建

重组后的质粒pcDNA3.1(+)-TGF-β1、pcDNA3.1(+)-bFGF进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，得到3条片段，长度分别为5427、478、1173 bp，与预期TGF-β1、bFGF基因和表达载体片段大小一致。见图6。

 

M1：DM 15 000(15 000、10 000、7500、5000、2500、1000、250 bp)；M2：DM 2000(2000、1000、750、500、250、100 bp)；1：HindⅢ单酶切pcDNA3.1(+)质粒；2：HindⅢ和XhoⅠ 双酶切pcDNA3.1(+)-bFGF质粒；3：HindⅢ单酶切pcDNA3.1(+)质粒；4：HindⅢ和XhoⅠ双酶切pcDNA3.1(+)-TGF-β1质粒。

图6 阳性克隆酶切鉴定

2.5 bFGF、TGF-β1基因在大鼠BMSCs中的表达

RT-PCR结果显示，bFGF、TGF-β1基因能够在SD大鼠BMSCs中表达。见图7。

 

M：DM 2000(2000、1000、750、500、250、100 bp)；1：pcDNA3.1(+)-bFGF，bFGF基因检测引物；2：pcDNA3.1(+)-TGF-β1bFGF，bFGF基因检测引物；3：pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1，bFGF基因检测引物；4：pcDNA3.1(+)，bFGF基因检测引物；5：空白对照，bFGF基因检测引物；6：pcDNA3.1(+)-bFGF，β-actin基因检测引物；7：pcDNA3.1(+)-TGF-β1，β-actin基因检测引物；8：pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1，β-actin基因检测引物；9：pcDNA3.1(+)，β-actin基因检测引物；10：空白对照，β-actin基因检测引物；11：pcDNA3.1(+)-bFGF，TGF-β1基因检测引物；12：pcDNA3.1(+)-TGF-β1，TGF-β1基因检测引物；13：pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1，TGF-β1基因检测引物；14：pcDNA3.1(+)，TGF-β1基因检测引物；15：空白对照，TGF-β1基因检测引物。

图7 bFGF、TGF-β1基因在BMSCs中的表达

2.6 bFGF、TGF-β1蛋白在大鼠BMSCs中的表达

pcDNA3.1(+)-bFGF、pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1在18 ku处可见特异性条带，与预期结果相一致。pcDNA3.1(+)-TGF-β1、pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1在25 ku处可见特异性条带，与预期结果相一致。见图8。

 

1：pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1；2：pcDNA3.1(+)-bFGF；3：pcDNA3.1(+)-TGF-β1；4：pcDNA3.1(+)；5：空白对照。

图8 bFGF、TGF-β1蛋白在BMSCs中的表达

3 讨论

牙周病因牙槽骨吸收、牙龈退缩、附着丧失等牙周软、硬组织改变[9]，最终导致牙齿松动脱落。牙周病的治疗一直致力于使牙周软、硬组织能够再生[10]。就引导牙周组织再生术与膜龈手术来看，虽然能够让牙周缺损组织在一定程度上得到修复，但需要注意的是牙周组织难以重新彻底实现附着。组织工程技术是近年来作为一种对缺失组织重建的技术，在骨科、软骨等领域取得了飞速的发展。目前，有研究[11-12]指出，在牙周病的治疗中引入组织工程技术，能够使牙周病损处的牙周组织再生。

构建细胞和生物材料的三维空间复合体是组织工程的核心，而种子细胞的选择至关重要。基于BMSCs易于获取、增殖能力较强，以及具有多向分化潜能的优点，本课题选用BMSCs作为种子细胞。有研究[3]表明，BMSCs在一定条件下，可促进骨组织再生。

刘佳他爸不让我见刘佳，我妈也说什么少出去丢人现眼，哼，想和喜欢的人在一起，怎么能说是丢人现眼？你们大人就喜欢乱用名词。

bFGF作为FGFs家族成员之一，具有强大的生物学活性，其存在于机体的脑、肝、肾上腺、骨等组织中。在体外培养状态下，bFGF能够促进MSCs、成骨细胞以及血管内皮细胞的增殖，是调控MSCs定向分化的主要生长因子之一[7]。Liu等[13]研究发现，在体外实验中，MSCs在bFGF作用下增殖明显。Nakahara等[14]观察到bFGF能够快速诱导血管形成，加快创伤愈合，促进牙周膜功能恢复、血管和骨生成，可用于修复牙槽骨缺损和促进牙周组织再生。Lee等[15]研究表明,纳米纤维支架中释放的bFGF可以促进人BMSCs的增殖和迁移，促进人脐血细胞的形成，并认为bFGF联合电纺纳米纤维有可能作为有效促进骨再生的生物膜而被使用。

TGF-β1是一种多功能细胞因子，其具有在调节机体免疫、细胞生长和分化、细胞外基质合成和贮存、胚胎发育及创伤修复等方面的作用。在骨代谢、骨愈合方面，TGF-β1可调控多种细胞(成骨细胞、成软骨细胞、破骨细胞)的增殖和分化，并影响骨基质合成。在体外培养状态下，低剂量TGF-β1可明显地促进DNA合成，促进成骨细胞增殖[16]。Park等[17]研究发现，TGF-β1修饰的MSCs通过抑制Ⅱ型胶原T细胞的增殖，下调IL-6、TNF-α和IL-7的表达，从而减少骨吸收和软骨破坏。TGF-β1对细胞外基质的合成或重塑有独特的作用[18]，在MSCs定向分化为成骨细胞中扮演着重要的角色[16]。TGF-β1、bFGF联合应用，可促进增殖效应，并可调控细胞外基质的合成和排布，诱导血管形成，促进组织修复。本实验通过脂质体转染方法，将外源性TGF-β1、bFGF基因修饰大鼠BMSCs，结果提示用脂质体转染的方法转染BMSCs能够获得TGF-β1和bFGF的高效表达，这可能为TGF-β1、bFGF在组织工程中应用提供一种新的途径。

在PLL合成频率源的设计中，为得到高精度的输出信号，一般由高精度的有源温补晶振提供高稳定性的输入信号。若在VCO与数字N分频器之间接入前置倍频器，PLL合成频率源的输出频率便可达到GHz数量级。

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(责任编辑：胡炜华)