鱼是公认的8大类主要致敏性食物之一[1]，在中国流行病学及食物过敏调查研究[2]发现，过敏人群的主要致敏物为水产品，因食用鱼、虾和蟹而导致过敏反应占较大比重，儿童水产食物过敏占总过敏数的50%，明显高于成人，且东部沿海地区过敏率高于内陆地区。马勇等[3]的报道显示，鱼/虾/蟹组合食物过敏在儿童食物过敏中排位第三(占16.39%)；据国外文献[4]报道，在沿海及鱼产品加工地区，鱼也是常见的食物过敏原；我国同样也有文献[5-6]显示，鱼类已成为最常见的食品过敏原之一。水产品过敏可导致患者出现皮肤红肿、哮喘、鼻炎等过敏性症状，严重时还伴随着虚脱、休克，甚至危及生命，严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量[7]。鱼作为八大类主要过敏原食品之一，已严重影响人们的生活质量，要对鱼类食物过敏性疾病进行防治就必须对鱼类过敏原进行系统深入的研究。草鱼为我国重要淡水鱼，目前只有李铮[8]对草鱼过敏原蛋白进行了研究，对于草鱼过敏原蛋白质组分的双向电泳分析尚未见报道。因此对草鱼过敏原蛋白质组分进行深入研究具有重要现实意义。

本实验选用草鱼作为研究对象，选用目前蛋白质研究分辨率最高的分析系统—双向电泳技术[9-10]，对草鱼过敏原蛋白质组分进行全面的分析，并联合免疫印迹技术，对其致敏组分进行免疫学特性鉴定。

将硝酸镉和4,4′-二(1-咪唑基)苯硫醚混合,水热法合成了一个新的六核配合Cd(BIDPT)2(NO3)2·(H2O)2,并对其进行了结构分析和表征.镉离子通过4,4′-二(1-咪唑基)苯硫醚配体桥联成8字型一维链结构.硝基苯化合物对配合物的荧光性质有不同程度的淬灭作用对2,4,6-三硝基苯酚的检测具有很好的灵敏性.

1 材料与方法

1.1 材料

1)标本：草鱼购于深圳市南山区人人乐超市。2)血清：20份对鱼过敏病人血清由深圳市人民医院提供。3)试剂：13 cm IPG(pH 3～10)胶条(GE公司)；尿素Urea，CHAPS，Triton X-100，DTT，溴酚蓝，矿物油，SDS(Sigma公司)，Tris(Sigma公司)，碘乙酰胺(GE公司)，低熔点琼脂糖，甘氨酸(Sigma公司)，丙烯酰胺(acrylamide)，甲叉双丙烯酰胺(bis)，过硫酸氨(ammonium persulfate)，TEMED，生物素标记的羊抗人IgE二抗(KPL公司)，HRP标记链霉亲和素(KPL公司)，硝酸纤维素膜(PALL公司)，预染protein marker(MBI Fermentas公司)等。4)仪器：低温冷冻高速离心机(2K15型，Sigma公司)，等电聚焦系统(Ettan IPGphor3，Amersham公司)，2D电泳系统(SE 600 Ruby；Amersham公司)，2D-WB转印系统(TE42，Amersham公司)等。

小矿车推到井底车场，“轰隆”，与前面的货车相撞，何良诸觉得胳膊像折了，麻酥感震到头皮，耳膜轰轰响，牙齿疼松了。过会儿，缓过劲，何良诸抬起头，感觉到一股圆形的风扑下来，风充满质感，上面是井筒。

1.2 实验方法

1.2.1 草鱼总蛋白的提取

大数据技术能够对大学生的生活进行相应的监测与评估，而且在分析时也显得更具有时效性和人性化特征。依托一站式数据资源平台，借助大数据分析手段，能够对学生的相关信息进行整合，诸如饭卡的消费状况、勤工俭学、兼职以及学习成绩等，从而使得对学生的分析更加准确和全面。另外，基于移动终端，能够充分发挥大数据技术的优势，对学生参与社团、班级等活动进行相应的记录，然后在后台对学校或某个区域的主体展开针对性研究，得出相应的数据报告，为学校以及家长提供针对性的建议，更好地促进大学生群体的发展。

价值取向指教师怎样的教学劳动能够为学生所认可和欣赏的价值评价。确立了科学课堂意识的教师，会以学生的身心特点为根据，区别学生的认知水平、需求特点，认真而不是随意的、真诚而不是敷衍的、民主而不是独断的、开放而不是封闭地进行课程决策、课程编制及课程实施，以此作为自己的根本价值主张，为学生量身定做课程的实施方案。

1.2.2 IPG胶条的水化

制备10 mL含0.05 mol·L-1 Tris-HCl、6 mol·L-1尿素、30%甘油、2%SDS和100 mg DTT的平衡缓冲液Ⅰ，制备10 mL含0.05 mol·L-1 Tris-HCl、6 mol·L-1尿素、30%甘油、2%SDS和400 mg 碘乙酰胺的平衡缓冲液Ⅱ。将等电聚焦后的胶条放入10 mL平衡缓冲液Ⅰ中，平衡15 min后用滤纸吸取多余的平衡液。从平衡缓冲液Ⅰ中取出胶条，再将胶条转入10 mL平衡缓冲液Ⅱ中，缓慢摇晃15 min，静置备用。

1.2.3 第一向等电聚焦电泳(IEF)

制备1 mL含9 mol·L-1尿素、4% CHAPS、60 mmol·L-1 DTT和2% IPG缓冲液的裂解液。用液氮将草鱼研磨成粉末，称取2 g样品加入上述1 mL裂解液中，冰上搅拌5 min，15 000 g离心50 min后，小心避开上层漂浮的脂质层，吸取的上清液即为草鱼总蛋白。Bradford法定量总蛋白浓度，其余上清液用于进行蛋白质电泳分析。

将上述步骤平衡好的胶条推至12%的分离胶上端靠紧,吸取10 μL预染蛋白Marker与10 μL的1%琼脂糖液混合后，加至上样滤纸片，然后将此上样滤纸片放置于胶条末端一侧，并与分离胶的上端接触。再覆盖上适量的1%琼脂糖液(75 ℃)进行封顶，使琼脂糖液5 min内凝固。将已封顶凝固的凝胶转移至电泳槽中，开始电泳[11]。

先用40%甲醇和10%乙酸按比例配制成固定液，再用30%甲醇、0.2%硫代硫酸钠和7%醋酸钠按比例配制成敏化液。等待上述步骤电泳结束后,剥下电泳槽中的凝胶进行硝酸银染色。染色步骤如下:将剥下的凝胶置于刚配制好的固定液中固定2次,每次分别固定15 min；然后置于刚配制好的敏化液中敏化30 min；用双蒸水洗3次,每次洗涤5 min;再置于硝酸银溶液(0.2% AgNO3)中反应20 min；用双蒸水洗涤1 min；最后置于显色液(2.5%无水Na2CO3,临用前加入40 μL 37%甲醛/100 mL溶液)振荡显色，直至出现清晰蛋白斑点后用1.46%EDTA终止反应10 min。显色后的胶板用扫描仪进行扫描，并用ImageMaster2D软件对胶板进行分析处理。

将含8 mol·L-1尿素、2% CHAPS、15 mmol·L-1 DTT和0.5% IPG缓冲液的250 μL水化液吸入水化盘中，将IPG干胶条(180 mm×3 mm×0.5 mm)去掉表面的保护膜，让IPG干胶条的胶面朝下方，小心放入水化盘，IPG干胶条尖端靠在阳极，平端靠在阴极。小心赶净气泡，使水化液浸湿整个IPG干胶条，再覆盖上适量的矿物油，让IPG干胶条水化过夜备用。

1.2.5 第二向SDS-PAGE电泳

将上述步骤中已完成水化的IPG胶条转移到通用型杯上样胶条槽，在IPG胶条表面上再覆盖上适量的矿物油。用双蒸水浸湿2个IEF电极片，再将浸湿的2个电极片分别放置于IPG胶条的两端，将电极压在两个电极片的外缘。安装好上样杯，用水化液将样品稀释为100 μg的上样量，上样到样品杯中。盖上IPGphor仪器的盖子，设置IPGphor仪器运行参数：恒压300 V 1 h,600 V 1 h,1000 V 1 h，8000 V 3 h[11]。

1.2.6 硝酸银染色

1.2.4 IPG胶条的平衡

1.2.7 免疫印迹

本文根据光程倍增光纤陀螺具有的平行、垂直偏振光交替环行的特性，理论推导陀螺中偏振合束器的有限消光比带来的一次、三次环行状态，然而这使得陀螺的奇偶时隙输出之间具有相关性，所以提出利用这种相关性对零偏进行相关抵消的陀螺信号处理方法，最后采集光程倍增光纤陀螺在室温下的零偏数据进行处理，验证该方法能够有效提高陀螺的精度.本文提出的陀螺信号处理方法利用的是光程倍增光纤陀螺本身具有的奇偶时隙输出之间的相关性，这不会因外界环境的影响而改变，所以，利用该相关性对陀螺零偏进行相关抵消的信号处理方法可为工程应用中光纤陀螺的精度优化提供借鉴.

上述双向电泳结束后,剥下电泳槽中的凝胶按常规的方法转印至NC膜，取下膜先用2%牛血清白蛋白(BSA)4 ℃封闭过夜；取出已封闭好的NC膜与1：5稀释的过敏病人阳性血清37 ℃孵育2 h；再加入经TBST(TBS/0.05%Tween-20)稀释(1：3000)生物素标记的抗人IgE抗体，经37 ℃孵育2 h；然后加入经TBST稀释(1：1000)的HRP标记的链霉亲和素，经37 ℃孵育1.5 h；以上每个步骤进行完后都用TBST洗涤3次，每次5 min。将膜放入新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)底物溶液中显色，再用双蒸水洗涤终止显色反应，观察结果，并用扫描仪对其进行扫描。

2 结果

2.1 草鱼总蛋白的双向电泳分离结果

本实验采用13 cm IPG胶条(pH 3～10)和12%的SDS-PAGE凝胶作为二项分离胶，结果显示，双向电泳蛋白点的分离效果较明显，大部分蛋白点独立且清晰(图1)。草鱼蛋白的2D胶分离结果经扫描后，利用ImageMaster2D软件进行分析，共检测到了388个蛋白点。

  

图1 草鱼总蛋白的双向电泳分离结果

2.2 草鱼总蛋白的相对分子质量和等电点分布

ImageMaster2D软件分析结果显示，草鱼蛋白质相对分子质量在15～124 kDa范围内，其中分布在15～55 kDa之间的蛋白质有336种，约占总蛋白质的86.6%(图2)。其次为55～75 kDa的蛋白质，占总蛋白质的10.1%。而大于75 kDa的蛋白质较少，仅占总蛋白质的3.3%。在等电点方面，分布在pH 5～8的蛋白质有245种，占总蛋白质的63.1%(图3)。其次为pH 4～5和pH 8～9的蛋白质，分别占总蛋白质的13.4%和9.5%。而pH 9～10的蛋白质最少，占总蛋白质的6.1%。

  

m/kDa图2 草鱼过敏原蛋白质组分的相对分子质量分布

  

pH图3 草鱼过敏原蛋白质组分的等电点分布

2.3 草鱼总蛋白的免疫印迹分析

免疫印迹结果显示，草鱼中可以与病人血清IgE结合的蛋白点有22个，蛋白质相对分子质量主要分布在20～55 kDa；等电点主要分布在pH 5～9。其中免疫原性较强的蛋白点为6、10、11、12号，相对分子质量分别为47与38 kDa，等电点分别为pH 7.36、9.13、8.7与8.14(图4，箭头标注；表1)。另外，同时进行的与正常血清的反应中未见与IgE结合的蛋白点。

  

图4 草鱼过敏原蛋白的免疫印迹结果

 

表1 草鱼蛋白质的22个过敏原组分

  

序号相对分子质量m/kDa等电点序号相对分子质量m/kDa等电点1935.6912388.142556.9513358.753535.9614358.194526.1315345.665525.3216287.036477.3617287.017397.0318276.978397.3119276.999395.8720235.9110389.1321235.5911388.722213.64

3 讨论

本实验前期[12-13]对我国四大海产经济鱼类中带鱼和大黄鱼的过敏原分别进行了初步的分离鉴定，近期又对牛奶[14]、花生[15]、小龙虾[16]等食物过敏原进行了研究，并制备了其相关的主要过敏原单克隆抗体。在前期研究工作基础上，本实验选用目前蛋白质研究分辨率最高的分析系统—双向电泳技术，对草鱼蛋白进行系统分析。提取草鱼总蛋白,进行双向电泳分离，银染法分析其总蛋白组成。2D结果显示草鱼的蛋白等电点集中分布在pH 5～8，蛋白质相对分子质量分布在15～55 kDa之间，与虾类的过敏原接近(为10～80 kDa)[17]。利用ImageMaster2D软件对其进行分析，共检测到了388个蛋白点。进一步通过免疫印迹使其与鱼过敏病人的血清反应,以检测其中可以与过敏病人血清IgE结合的蛋白点。WB结果显示草鱼中可以与病人血清IgE结合的蛋白点有22个，等电点集中分布在pH 5～9，蛋白质相对分子质量主要在20～55 kDa之间。另外，本实验运用2D技术分离了草鱼总蛋白，与普通SDS-PAGE分离结果相比，更加直观和准确，使人们对草鱼的蛋白质总体分布有了明确的认识。同时，本实验提取草鱼总蛋白采用了超速离心法，最大限度地减少了提取过程中蛋白质的损失，而且对蛋白质提取缓冲液的成分以及等电聚焦程序都进行了优化，以使等电聚焦达到最佳效果；对草鱼过敏原蛋白质组分进行了全面的分析，对其致敏组分进行免疫学特性鉴定，构建了较为完整的草鱼过敏原蛋白质组分图谱，为草鱼蛋白质组学数据库及其过敏原组学数据库的建立奠定了基础,同时也为草鱼过敏的诊断和治疗提供了实验依据。

在当前高考制度改革工作进行的过程中，将以往语文总分数150分提升到180分，将其放置在最为重要的地位上，高考试卷当中对语文知识的考查难度大幅度提升，语文演变为高考当中最容易将学生之间差距拉开的一门课程。因此，在高考过程中，语文应当充分地得到重视，语文考试中的阅读更应当充分地得到重视。仅仅讲述教科书和教辅资料，难以适应高考政策中提出的要求。从高考制度改革中可以发现的是，阅读的重要性得到了教育部门的认可。在此背景之下，教师及学校应当积极推广阅读，促使学生在学习的过程中养成一定阅读兴趣，从而也就可以为我国教育事业发展做出一定贡献，也可以为我国实现长远战略发展目标奠定坚实的基础。

参考文献：

[1] Burks A W，Tang M，Sicherer S，et al.ICON:food allergy[J].J Allergy Clin Immun，2012,129(4):906-920.

[2] 张永霞,杨阳,蔡秋凤,等.水产食物过敏原及其抗原表位的研究进展[J].中国渔业质量与标准,2015，5(5):1-8.

[3] 马勇,李莉.引发儿童过敏的常见食物过敏原分布探讨[J].慢性病学杂志,2016,17(3):321-322.

[4] Sampson H A.Food allergy[J].J Allergy Clin Immunol,2003,111(2 Suppl)：S540-S547.

[5] 许秀宽,陈志宏,张洪辉.2215例变态反应性疾病生物共振过敏原检测结果分析[J].中外医疗,2017,37(3):35-37.

[6] 谷娅楠,王贞,朱鸿,等.大连地区3259例过敏患者过敏原结果分析[J].重庆医学,2014,43(26):3505-3507.

[7] 刘光明,曹敏杰,蔡秋凤,等.水产品过敏原的研究现状和展望[J].中国食品学报,2012(5):1-9.

[8] 李铮.草鱼主要过敏原小清蛋白亚型纯化鉴定及加工对过敏原影响的研究[D].北京：中国农业大学,2014.

[9] 刘硕,蔡笃程,李春林,等.双向电泳结合免疫印迹技术分析蜉蝣变应原[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2017,11(1):1-5.

[10] 赵玉红,李欣,崔建林,等.一种适于本科实验教学的双向电泳技术体系[J].实验室研究与探索,2017,36(1):177-179，184.

[11] 李燕良,邬玉兰,闫浩,等.东亚飞蝗消化系统蛋白质组双向电泳的分析[J].江西师范大学学报(自然科学版),2012,56(6):569-573.

[12] 杨睿,吴海强,刘志刚.带鱼过敏原的分离、鉴定与纯化[J].热带医学杂志,2008，8(11)：1112-1127.

[13] 杨睿,吴海强,刘志刚.大黄鱼过敏原的提取、分离及免疫学特性鉴定[J].卫生研究,2009,38(1):60-62.

[14] 陈献雄,邬玉兰,吉琼梅,等.牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立[J].食品安全质量检测学报,2015,6(11):4545-4550.

[15] 陈献雄,邬玉兰,刘志刚,等.花生主要过敏原Arah1单克隆抗体的制备与应用[J].免疫学杂志,2017,33(1):68-72.

[16] 陈献雄,邬玉兰,吉琼梅,等.小龙虾钙结合蛋白的免疫学特性鉴定与单克隆抗体的制备[J].南昌大学学报(医学版),2017,57(2):29-33.

[17] 黄建芳,林婷婷,向军俭,等.河虾主要过敏组分的分离、纯化、鉴定及其致敏性分析[J].细胞与分子免疫学杂志,2010,26(5):444-446，452.

(责任编辑：况荣华)