根据美国国立卫生研究院最新统计数据，2015年肺癌发病人数和死亡人数分别达224 390人和158 080人[1]。随着空气污染的加重，中国肺癌的发病率和死亡率也不容乐观[2-3]。肺癌的恶性程度大，治愈率低，其预防除了建立良好的生活方式外，合理的饮食习惯也具有不可替代的作用。在人类膳食中存在许多抗癌物质，同时也存在着大量的致癌物质，这些抗癌物与致癌物在人体内相互作用，此消彼长。因此，人类的膳食与癌症的抵抗和发生有着密切的关系，且膳食中的抗癌、防癌物质成为肿瘤化学预防的研究热点。

牛磺酸(Tau)是具有简单化学结构的含硫氨基酸，也是人体的条件必需营养素。目前，Tau已应用于解热消炎、肝胆疾病[4]、心血管疾病[5]、糖尿病[6-7]、白内障[8-9]等，而关于Tau与肿瘤相互作用的研究较少，作用机制也尚未明确。本研究探讨Tau对人肺癌细胞株A549细胞凋亡的作用及其初步机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肺癌细胞株A549、正常人胚肾细胞株293T均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。Tau购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)均购自美国GIBCO公司；顺铂(DDP)购自齐鲁制药有限公司，批号：050101；p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)多克隆抗体(#Q9BXH1)购自美国Cell Signaling Technology公司；Bax单克隆抗体(sc-526)、Bcl-2单克隆抗体(sc-783)、GAPDH多克隆抗体(TA-08)均购自美国Santa Cruz公司；辣根酶标记山羊抗鼠IgG(ZDR-5307)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZDR-5306)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Caspase-9(C1157)、Caspase3(C1115)活性检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。CO2培养箱购自日本Sanyo公司，型号：MCO175；流式细胞仪购自美国BD公司，型号：FACSCalibur；酶标仪购自美国Molecular Devices公司，型号：SpectraMax M5；超速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，型号：5804R；微量核酸蛋白测定仪购自德国Implen公司，型号：nanophotometer；垂直电泳槽、Trans-Blot转印槽均购自美国Bio-Rad公司，型号：MINI-P；超纯水器购自美国Millipore公司，型号：MILLI-Q。

小学科学与其他学科最大的不同就是科学学科的知识与日常生活联系更紧密，且理论知识更加抽象。教师在开展教学活动时，要注重将教学内容与生活实际联系起来，从而点燃学生学习热情，促使科学学科教学更加趋向生活化。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与细胞分组、药物处理

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖

将人肺癌细胞株A549用含10%FBS的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。Tau用无血清培养基溶解，作用人肺癌细胞株A549。将A549细胞分为6组：Control组(正常对照组，未给予任何药物处理)和Tau 1组(给予Tau 10 mmol·L-1)、Tau 2组(给予Tau 20 mmol·L-1)、Tau 3组(给予Tau 40 mmol·L-1)、Tau 4组(给予Tau 80 mmol·L-1)、Tau 5组(给予Tau 160 mmol·L-1)；阳性对照组(给予DDP 4 mg·L-1)，作用时间分别为24、48、72 h。

将Control组、Tau 1-5组和阳性对照组细胞置于96孔板中，另外增加一组调零孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养24、48、72 h。然后，加入5 g·L-1的MTT 20 μL。培养4 h后，弃各孔溶液，加入150 μL的DMSO，震荡10 min。在酶标仪上490 nm波长处检测各孔的吸光度值(OD值)，并计算抑制率，抑制率(%)=(1-实验组OD值/Control组OD值)×100%。

回想常去奶奶家玩的那些个无忧无虑的日子，我很难尝到那夜似的好菜，很难看到那夜似的好节目了。还有，再也看不到调皮地比着胜利手势的堂妹了。

习近平总书记指出：“我们要坚持道路自信、理论自信、制度自信，最根本的还有一个文化自信。”实现中华民族伟大复兴，乃是自鸦片战争之后170多年以来，亿万中华儿女最大的中国梦。文化是一个国家、一个民族的灵魂，无论哪一个国家、哪一个民族，如果不珍惜自己的文化，就会丧失自己的灵魂，再无生命力可言。文化兴则国运兴，文化强则民族强，没有高度的文化自信，就没有中华民族的伟大复兴。只有坚持从延续民族文化血脉中开拓前进，我们才能做好今天的事业，才能实现伟大的中国梦。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

为响应国家政策，推动武术“走出去”，2016年7月22日，国家体育总局武术运动管理中心印发了《中国武术发展五年规划(2016-2020年)》，规划中指出：加强武术的国际交流与合作,加大对国外武术教练员、裁判员和运动员的培训，增加武术师资外派数量，扩大武术器材援助和输出，增派武术交流访问团，定期举办各类武术展示交流活动，逐步加大武术援外力度，重点与国际武术联合会成员国建立长期合作关系[4]。

各组细胞用Binding Buffer 500 μL悬浮，加入Annexin V-FITC 5 μL，混匀。再加入Propidium Iodide 5 μL，混匀。于室温避光反应15 min。使用流式细胞仪、采用流式细胞术检测细胞凋亡率。

酶标仪检测结果显示，经Tau处理48 h后，Tau 3、4、5组Caspase-3、Caspase-9活性均明显升高，且呈剂量依赖性(图3)，Tau 3、4、5组Caspase-3、Caspase-9活性与Control组比较差异均有统计学意义(均P<0.01，图3B)，表明Tau可以诱导A549细胞凋亡，从而抑制其体外增殖。

采用分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9的活性，具体操作根据试剂盒说明书进行。在酶标仪405 nm处检测吸光度值(OD值)，以OD值代表Caspase-3、Caspase-9的活性。

流式细胞术检测结果(其中图2A为Control组流式细胞图)显示，经Tau处理48 h后，Tau可以诱导A549细胞凋亡，并且随着Tau浓度的增加，A549细胞凋亡率呈逐渐升高的趋势。Tau 3组的早期和晚期细胞凋亡率分别为8.44%、5.71%(图2B)，Tau 4组的早期和晚期细胞凋亡率分别为10.3%、7.21%(图2C)，Tau 5组的早期和晚期细胞凋亡率分别为13.57%、9.07%(图2D)。Tau 3、4、5组早期和晚期细胞凋亡率与Control组比较差异有统计学意义(P<0.01，图2E)。

**P<0.01与Control组比较。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据处理。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

上式可见，稀硝酸腐蚀金属产生一氧化氮（NO）气体，它通常在空气中氧化为二氧化氮（NO 2），遇水汽后又重新生成硝酸。同时，随着不断与金属反应，溶液浓度逐渐降低，产生的气体逐步变为一氧化二氮（N 2O）、氮气（N 2）、硝酸铵等。因此，工作时需确保非常好的通风条件，将有毒气体排出室外。事实上，少量吸入此类气体不会导致严重后果，但长期在高浓度环境中工作，会增加患肺水肿的风险。并且，这些氮氧化物附着在机器设备上，长期积累下会造成腐蚀性破坏。

2 结果

2.1 Tau抑制A549细胞增殖

MTT比色法检测结果显示，经Tau处理48 h后，A549细胞增殖活性出现降低趋势，Tau可以抑制A549细胞增殖，并随着Tau浓度的增加和作用时间的延长，其对A549细胞增殖抑制作用逐渐增强(图1A)。Tau的不同浓度和不同作用时间对293T细胞增殖无明显影响(图1B)。Tau作用24、48、72 h后，对A549细胞的IC50分别是263.50、171.47、126.45 mmol·L-1(图1C)。

独立学院的师资队伍一般主要由专职教师（有时也称自有教师或专职专任教师）、专任教师和外聘教师三部分构成。专职教师通常是指人事关系在独立学院委托的人才服务机构、聘期一年以上，承担教学工作的人员，主要来源于应届硕士研究生，是独立学院自有师资队伍的核心部分；专任教师是指由独立学院的母体高校负责派出的有较丰富教学经验的教师，聘期为一年（含一年）以上，是独立学院师资的重要组成部分；外聘教师是指独立学院聘任的除母体高校之外的其他高校教师或部分具有较丰富实践经验及较高理论水平的行业工作人员，是独立学院师资构成的有益补充。

 

时间t/h 时间t/h 时间t/h

A：Tau对A549细胞的抑制率；B：Tau各浓度组处理后293T细胞的OD值；C：A549细胞对Tau的IC50。

将各组细胞置于96孔板在37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，收集细胞蛋白，加热变性，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。上样前，调整蛋白浓度，使每孔的总蛋白含量为30 μg。电泳结束后，用湿转法将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。用PVDF膜与1:500浓度的PUMA、Bax和Bcl-2抗体反应，置于4 ℃ 冰箱，结合6 h。缓冲液清洗后与1:1500浓度的二抗(用辣根过氧化物酶标记)结合2 h，再用缓冲液清洗。然后，用ECL发光液与膜反应，于暗室内曝光。用Image-Pro Plus6.0凝胶图像分析软件对蛋白条带进行灰度值扫描，行半定量分析。

图1 Tau对A549细胞增殖的影响

2.2 Tau诱导A549细胞凋亡

1.2.5 Western blot检测PUMA、BAX、Bcl-2蛋白的表达水平

 

A—D：流式细胞图，A为Control组，B为Tau 3组，C为Tau 4组，D为Tau 5组；E：柱状图。**P<0.01与Control组比较。

图2 Tau诱导A549细胞凋亡

2.3 Caspase-3、Caspase-9的活性分析

1.2.4 Caspase-3、Caspase-9活性的检测

 

A：Caspase-3活性；B：Caspase-9活性。**P<0.01与Control组比较。

图3 Tau对A549细胞中Caspase-3、Caspase-9活性的影响

2.4 PUMA、Bax、Bcl-2蛋白的表达水平

Western Blot检测结果显示，经Tau作用48 h后，随着Tau浓度的增加，A549细胞的促凋亡蛋白PUMA、Bax蛋白表达水平均明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平明显下调，Tau 3、4、5组PUMA、Bax、Bcl-2蛋白表达水平与Control组比较差异均有统计学意义(均P<0.01，图4A—D)。Tau 3、4、5组Bax/Bcl-2比值均明显高于Control组(均P<0.01，图4E)。

 

A：Western blot检测的电泳图；B—E：柱状图。**P<0.01与Control组比较。

图4 Western Blot检测A549细胞中PUMA、Bax和Bcl-2蛋白的表达变化

3 讨论

Tau对人体有着不可或缺的作用，人的许多系统性疾病都与Tau有或多或少的联系。从人类发现Tau的重要作用以来，人们对Tau各种生物学功能的研究一直没有中断。

Tau可以对抗肿瘤的生长[10]。Tau的抗肿瘤机制为以下几点：1)Tau对化疗药有增效减毒作用[11-13]；2)Tau通过提高机体抗氧化能力抑制肿瘤的生长[14]；3)Tau通过增强机体免疫力，从而起到对肿瘤的免疫排斥作用[15-17]；4)Tau通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的生长[18-19]。

Bcl-2家族蛋白在线粒体凋亡途径中起着重要的作用。Bcl-2家族成员可以分为：抗凋亡蛋白(如Bcl-2)和促凋亡蛋白(如Bax)。当细胞受到通过线粒体凋亡途径的凋亡刺激时，Bcl-2家族蛋白(如BH3-only蛋白)与其他蛋白相互作用，使线粒体接收到凋亡信号，打开线粒体膜通道，促进凋亡因子从线粒体向胞质的释放，进而激活Caspases级联反应，促进凋亡。

PUMA有着强大的促凋亡作用，是BH3-only蛋白家族成员之一。当细胞受到凋亡刺激时，诱导PUMA表达增加，其BH3结构域与Bcl-2等抑凋亡蛋白结合，从而表现出其强大、全面的促凋亡作用[20-21]。PUMA蛋白可以被抗肿瘤药物诱导表达而增加。如顺铂、阿霉素诱导PUMA表达具有时间和剂量依赖性[22-23]。大蒜素[24]、绿茶多酚[25]都是通过诱导PUMA表达而增加，促进了肠癌细胞LoVo发生凋亡，而抑制PUMA表达后，药物诱导细胞凋亡的作用明显减弱。另外，外源性PUMA同样可以诱导肿瘤细胞发生凋亡[26-27]。

1978年12月，党的十一届三中全会拉开了我国改革开放的序幕，同年十一月份，当时的国家物资总局组织有关部门和地方领导赴日本考察，首次将物流的概念引入国内。

本研究是从细胞凋亡方面来探讨Tau的抗肿瘤作用。本研究证实了Tau可以抑制人肺癌细胞株A549细胞增殖，并可促进A549细胞发生凋亡。另本研究从线粒体凋亡途径来探讨Tau诱导人肺癌细胞株A549发生凋亡的分子机制。结果发现，Tau可能通过上调PUMA表达，进而引起凋亡相关蛋白——Bax表达上调和Bcl-2下调表达，导致Caspase-3、Caspase-9活性均升高来介导A549细胞发生凋亡，其与文静等[28-30]研究的结果相一致。此外，Tau对人正常细胞(人胚肾细胞293T)没有抑制其细胞活性和增殖，这进一步验证Tau在抗肺癌方面是一个理想的化学预防剂。

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(责任编辑：胡炜华)