肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一，在中国，肝细胞癌位居肿瘤发病率和病死率的前列。虽然外科手术及术后护理技术不断提升，但肝癌患者病死率依然逐年增加[1]。因此，深入研究肝细胞癌发生发展的潜在分子机制可为临床预防和治疗肝癌开辟新的途径。微小RNA(microRNA，miR)是一类长度为18～25个核糖核苷酸非编码的小分子RNA，广泛存在于真核生物中，在转录后水平和翻译水平调节靶基因的表达。miR-19a位于人类第13号染色体上C1orf25基因初级转录本的第3个内含子区[2]。研究显示，miR-19a在肺癌、食管癌、结肠癌等多种肿瘤细胞中均高表达[3-5]，高表达的miR-19a促进肺腺癌细胞向间充质细胞转化[6]，进而促进肿瘤的发生发展。本研究探讨miR-19a在肝癌组织中的表达情况，通过上调miR-19a在肝癌HepG2细胞中的表达水平，观察其对细胞增殖和迁移等细胞生物学行为的影响，并通过检测上皮-间质样转化(EMT)相关基因的表达情况进一步分析其对肝癌细胞EMT转化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM高糖培养液购自美国HyClone公司；胎牛血清、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司；人miR-19a模拟物(miR-19a mimics，正义链序列为5’-UGUGCAAAUCUAUGCAAAAC-UGA-3’，反义链序列为5’-AGUUUUGCAU-AGAUUUGCACAUU-3’)和其阴性对照(miR negative control，miR-NC，正义链序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链序列为5’-ACGUGACACGUUCGGA-3’)购自上海吉玛制药技术有限公司；MTT和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；总RNA提取试剂TRIzol和转染试剂LipofectAMINE 2000购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Promega公司；Transwell小室购自美国Corning公司；反转录引物和PCR引物由上海生工技术有限公司合成，以U6或GAPDH作为内参照，引物序列见表1；兔抗鼠E-cad、兔抗鼠N-cad、兔抗鼠Vimentin抗体购自美国Proteintech公司；羊抗兔荧光二抗购自美国Bioworld公司。见表1。

1.2 细胞及细胞培养 人肝癌HepG2细胞株由承德医学院附属医院中心实验室保存，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素的DMEM培养液，置于37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。每1～2天换液1次，细胞生长至融合度为70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(quantificational real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)检测肝癌组织中miR-19a的表达水平 收集2013至2014年在承德医学院附属医院进行手术切除的保存完好的肝癌及相应的癌旁组织(距相应癌组织边缘>5 cm)标本25例。所有标本均在液氮中冻存，所有患者手术前均未进行放疗和化疗。本研究所用标本均得到患者的知情同意，并获得承德医学院附属医院伦理委员会的批准。取出液氮中保存的组织标本，用TRIzol裂解并抽提组织标本中的总RNA，应用反转录试剂盒将各标本的总RNA反转成cDNA，其中miR-19a和U6使用特异性引物进行反转录。以得到的cDNA为模板，按实时荧光定量PCR试剂盒说明书提供的方法检测miR-19a的表达，以U6为内参照。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40个循环。以2-△△CT表示miR-19a的相对表达水平。见表1。

 

表1 qRT-PCR所需引物序列

  

组别Primersequence(5’-3’)GAPDHF:CGGATTTGGTCGTATTGGGR:TGCTGGAAGATGGTGATGGGATTMiR-19aRT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACTCAGTF:TGTGCAAATCTATGCAAAR:GTGCAGGGTCCGAGGTATTCU6RT:AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTGF:CTCGCTTCGGCAGCACAR:AACGCTTCACGAATTTGCGTVimentinF:AGTGCCTGGAACGTCAGATGR:?CAGCAGCTTCCTGTAGGTGGE-cadF:TGGACAGGGAGGATTTTGAGR:ACCTGAGGCTTTGGATTCCTN-cadF:CCACAGCTCCACCATATGACTR:CCCCAGTCGTTCAGGTAATC

1.4 miR-19a-mimic转染HepG2细胞 获得处于对数生长期的HepG2细胞，接种于六孔板(3×105/孔)，待细胞呈70%～80%融合状态时，按LipofectAMINE 2 000 转染试剂说明书进行转染。实验分3组：(1)miR-19a-mimic转染组；(2)阴性对照组，miR-NC转染组;(3)空白对照组，只加转染试剂。

1.5 qRT-PCR检测miR-19a-mimic转染后HepG2细胞中miR-19a的表达水平 收集1.4节转染24 h后的各组细胞，按实时荧光定量PCR方法检测和分析各组细胞中miR-19a的表达水平。

2.4 miR-19a-mimics可促进HepG2细胞的迁移 miR-19a-mimics转染HepG2细胞后，应用Transwell小室检测细胞的迁移情况，miR-19a-mimics转染组HepG2细胞穿过滤膜的细胞数为(44.25±2.21)，与空白对照组(29.75±2.75)和阴性对照组的(32.75±2.21)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与空白对照组HepG2细胞穿过滤膜的细胞数之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见图2C。

本文试图通过对华裔青少年参加“中国寻根之旅”活动状况的分析，揭示“寻根之旅”在培养华裔青少年的族群意识、促进华族文化认同、加强华族文化传承等方面的重要作用。在此基础之上，以“寻根之旅”为突破口，探寻华裔青少年对华族文化认同的方式和途径，同时探寻如何利用这一活动推进东南亚华文教育的发展壮大。

2.5 miR-19a-mimics可调节HepG2细胞EMT相关基因和蛋白的表达 miR-19a-mimics转染HepG2细胞48h后，应用qRT-PCR检测细胞中E-cad、N-cad和Vimentin mRNA的表达情况，以阴性对照组HepG2细胞mRNA的表达水平作为1，miR-19a-mimics转染HepG2细胞中E-cad mRNA的表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组，N-cad mRNA和Vimentin mRNA的表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组与空白对照组HepG2细胞EMT相关基因表达水平之间的差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测结果与qRT-PCR的检测结果一致。见图3、4。

2.3 miR-19a-mimics可促进HepG2细胞的增殖 miR-19a-mimics转染HepG2细胞后，应用MTT法检测细胞的增殖情况，与阴性对照组和空白对照组相比，miR-19a-mimics转染组HepG2细胞的增殖能力明显增强，差异有统计学意义(P<0.01)；阴性对照组与空白对照组HepG2细胞的增殖情况之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见图2B。

1.9 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示；2组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验，以上实验均独立重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。

In Table 2 we report the anthropometric and nutritional data of the 513 patients enrolled in the 19 gastroenterology units participating in the study: 51.4% were males and 48.6% females, and the average age was 59.8 ± 17.8 years without a significant difference between the centers.

2 结果

2.2 miR-19a-mimics转染后HepG2细胞中miR-19a的表达水平上调 miR-19a-mimics转染HepG2细胞24 h后，应用qRT-PCR检测各组细胞中miR-19a的表达水平，以阴性对照组细胞中miR-19a的表达水平为1，结果显示，miR-19a-mimics转染组细胞中miR-19a的表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)，阴性对照组与空白对照组细胞中miR-19a的表达水平之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见图2A。

现代生活中，随着摩天大楼的拔节增高，越来越多人出行需要乘坐电梯，电梯成为垂直交通的必然途径，同时也成为考量市民和乘客文明程度的一把标尺。电梯，确实是一条风景线。美化乘梯环境，加强电梯安全监管工作，排队礼让，确保电梯安全运行，愿每位乘梯者都成为“电梯风景”中文明和谐的元素！

 

2.1 肝细胞癌组织中miR-19a的表达水平 qRT-PCR检测25例肝细胞癌组织及其相应癌旁组织中miR-19a的表达水平，以癌旁组织的表达水平为1，结果显示(图1)，肝癌组织中miR-19a的表达水平明显高于其相应的癌旁组织(t=7.015，P<0.01)，说明miR-19a在肝癌中呈高表达状态。见图1。

1.8 qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测miR-19a-mimic转染后HepG2细胞中EMT相关基因和蛋白的表达 (1)用TRIzol试剂和反转录试剂盒提取转染24h后的各组细胞的总RNA，并将其反转录成cDNA，以此cDNA为模板按1.3节的方法进行实时荧光定量PCR检测，分析各组细胞EMT相关基因mRNA的表达水平。(2)用RIPA裂解液裂解并提取转染48 h 后各组细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取蛋白质50 μg/孔进行10% SDA-PAGE，将电泳分离后的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂牛奶的封闭液于室温下反应1 h，按说明书加入稀释后的一抗，4℃反应过夜，TBST洗涤后，分别加入1∶1 000稀释的羊抗兔荧光二抗，室温反应1 h(避光)，用Odyssey双色红外荧光扫描系统进行成像并分析。

  

图1 qRT-PCR检测肝癌组织及其癌旁组织中miR-19a的表达水平

1.6 MTT法检测miR-19a-mimic转染后HepG2细胞的增殖活性 收集转染6 h后3各组细胞，接种于96孔板(3×103个细胞/孔)，每组设6个重复孔。分别于培养0、1、2、3、4 d后，加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl/孔，继续培养4 h后，弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO并于室温振荡15 min。用全自动定量酶标仪在波长492 nm处测定吸光度(D)值，计算平均值。

Analysis on the variability of housing pattern under the family pension model

 

 

 

 

图2 实时荧光定量PCR (A)、MTT (B)和Ttanswell (C)法分别检测miR-19a-mimic 转染后HepG2细胞中miR-19a的表达水平、HepG2细胞的增殖和迁移能力(蛋白质印迹法×400)

1.7 Transwell小室法检测miR-19a-mimic转染后HepG2细胞的迁移能力 将Transwell小室置于无菌24孔板中，收集转染6 h后的3组细胞，以无血清DMEM培养液重悬细胞，接种于Transwell的上室(5×104个细胞/小室)中，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液，细胞培养24 h后，取出Transwell小室，用棉签将上室的内面擦净，下室面用4%多聚甲醛溶液固定，风干后吉姆萨染色，置于倒置显微镜镜下拍照。随机观察5个视野(×400)并计数穿膜细胞数。

主要荣誉：2016第六届国际摄影艺术展人像组金奖，2017西班牙TORRETES冠军杯摄影大赛彩色组金奖，2018PPAC上半年国际摄影比赛儿童组第一名

 

图3 实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测miR-19a-mimic转染后HepG2细胞中E-cad、N-cad和Vimentin mRNA的表达水平

 

图4 蛋白质印迹法检测miR-19a-mimic转染后HepG2细胞中E-cad、N-cad和Vimentin 蛋白的表达水平

3 讨论

越来越多的研究表明，miRNA在肿瘤的发生发展和转移等过程中发挥着重要作用[7-10]。miRNA不但参与机体正常的生长和发育过程，在肿瘤等多种疾病的发生发展中也扮演着重要的角色。miRNA通过抑制翻译过程或者通过与靶基因的3，-非翻译区(3’-untranslated Regions，3’-UTR)互补结合，促使靶mRNA降解而发挥作用[11]。因此，深入研究miRNA作用机制将为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。本研究探讨miR-19a在肝癌组织中的表达情况，并通过体外实验研究miR-19a对肝癌HepG2细胞增殖、迁移等细胞生物学行为的影响，探讨诱导肝癌细胞EMT及其机制。

本研究首先应用实时荧光定量PCR法检测了25例肝癌及其相应癌旁组织中miR-19a的表达水平。结果显示，与癌旁组织相比，miR-19a在肝癌组织中呈高表达。miR-19a 属于miR-17-92基因簇成员，miR-17-92是一个高度保守的多顺反子miRNA，编码miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a等6个miRNAs。研究发现，miR-17-92基因簇在肺癌、B细胞淋巴瘤、胃癌等多种肿瘤细胞中均高表达[7-10]，并促进肿瘤细胞的增殖[3,4]。此外，miR-17-92与c-myc相互作用促进小鼠淋巴瘤的发生发展[7]，表明miR-17-92基因的促肿瘤作用。miR-19在miR-17-92基因的促肿瘤作用中发挥重要作用[12,13]，非小细胞肺癌中高表达的miR-19a 和miR-19b-1 与肿瘤的侵袭和转移密切相关[14-16]，并且血清中高表达的miR-19a和miR-19b-1是非小细胞肺癌患者预后差的独立影响因素[15,16]。研究表明，miR-19a 或miR-19b-1既可以通过调节MXD1促进宫颈癌细胞[17]、结肠癌细胞[18]和胃癌细胞的侵袭和转移，又可以通过调节TP53促进乳腺癌细胞[19]的侵袭和转移。以上现象表明，miR-19参与肿瘤细胞的侵袭和转移，但其作用机制有待进一步研究。

为了进一步探索miR-19a对肝癌细胞生物学功能的影响，本研究应用体外实验将miR-19a-mimic转染入肝癌HepG2细胞中，使miR-19a在肝癌细胞中过表达。MTT法检测发现，过表达miR-19a后HepG2细胞的增殖能力明显增强。Transwell小室法的检测结果显示，过表达miR-19a后HepG2细胞的迁移能力较阴性对照组明显增强，说明miR-19a可促进细胞的迁移。上皮细胞发生上皮间质转化是造成肿瘤细胞侵袭和转移的重要分子机制之一。E-cad和N-cad是Ca2+依赖的调节细胞间黏附作用的跨膜糖蛋白，E-cad主要分布于上皮组织中，对于维持上皮细胞形态结构的完整性发挥重要作用，N-cad一般表达于间充质细胞，在上皮细胞中较少表达，E-cad表达下调和N-cad表达上调可促进肿瘤的侵袭和转移[20,21]。Vimentin是一种细胞骨架蛋白，广泛分布于成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞等间质细胞，也被认为是EMT的一个重要分子标志物。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，过表达miR-19a后HepG2细胞E-cad表达下调，N-cad和Vimentin表达上调，表明HepG2细胞发生EMT转变，提示EMT可能是miR-19a促进肝癌细胞侵袭和转移的重要机制。

总之，本研究证实miR-19a在肝癌组织中呈高表达状态，促进肝癌HepG2细胞的增殖及迁移能力，通过下调E-cad表达、上调N-cad和Vimentin表达诱导肝癌HepG2细胞的EMT。本研究将为深入研究肝细胞癌发生发展的分子机制和干预治疗奠定理论基础。

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