冠状动脉旁路移植术被认为是迄今为止最有效的治疗冠心病的方法之一,而血管桥的主要来源仍以自体静脉为主,但其远期通畅率不高。一项研究表明病人年龄小于70岁,以胸廓内动脉、桡动脉为最佳血管桥,而当病人年龄超过70岁时,以大隐静脉为血管桥比较适合[1]。CABG后10a,约50%的静脉桥出现严重的再狭窄或完全阻塞[2],CatS在血管再狭窄中起重要作用,CatS 在损伤后的血管内膜上会出现表达增多[3],抑制CatS可以降低血管的损伤及再狭窄[4]。

在小鼠模型上,CatS基因敲除后能否有效抑制CABG后静脉桥血管再狭窄,迄今尚不明确,为验证CatS基因敲除后在CABG后静脉桥再狭窄有抑制作用,本研究以CatS基因敲除后小鼠为研究对象,建立小鼠下腔静脉-颈动脉移植模型,通过基因敲除鉴定,显微镜观察血管内膜增生,来证实CatS基因敲除后对静脉桥再狭窄有抑制作用,同时应用ELISA 基质金属蛋白酶(MMP-9)检测来探讨CatS基因敲除后对静脉桥再狭窄发挥抑制作用的机制,为CABG后静脉桥再狭窄的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CatS基因敲除(Cathepsin S-deficient,CatS-/-)小鼠(品系为C57BL/6),购自Jackson Lab;C57BL/6小鼠,由北京市心肺血管疾病研究所提供。均为健康雄性,体重约18～22g,分成2组,即:C57BL/6小鼠组(对照组)和CatS基因敲除小鼠组(实验组)。

1.2 实验方法

利用Cuff套管技术(见图1)建立小鼠下腔静脉-颈动脉移植模型,每组小鼠数量为36只。移植后喂养条件、所处环境等相同,分别于移植术后各时间点(8h、1d、3d、7d、14d和28d)取材移植静脉桥进行试验。通过免疫组化技术制备移植静脉桥组织切片,显微镜观察两组小鼠移植血管内膜增生情况;取移植静脉血管剪碎,通过ELISA检测两组小鼠移植血管内MMP-9酶的含量;剪取小鼠尾巴4mm,通过DNA扩增技术提取小鼠DNA,鼠尾DNA分别与CatS(-/-)和C57BL/6的引物进行PCR,从而对小鼠基因型进行鉴定。

(2)实例探究。D企业实行企业管理模式更新，建立企业现代化管理方法时，企业管理人员，一改原有的家庭式管理模式，重新依据企业管理在职人员能力，进行岗位调节，也从社会中聘请专业的人资管理，财务管理等人员；同时，管理人员也在现有企业薪资、用人及生产与检验等环节上，加强了企业管理之间的事务安排的紧密度、科学性安排，继而达到了多重检验信息的协调性统筹效果。

 

表1 鉴定PCR引物序列

 

Tab.1 Identification of PCR primer sequence

  

基因上游引物5'-3'下游引物5'-3'CatS(-/-)CTCTGTGTAGCCTGG AATTCCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCC57BL/6CTTGAAGGGCAGCTGAAGCTGGTAGGA AGCGTCTGCCTCTAT

2 实验结果

2.1 PCR引物序列如下所示(见表2)

“那我试试。”向来抵触朝敏数落的他，这回却认真地答应了。在儿子发生这样的变化以后，他也意识到孩子走上偏道跟自己错误的示范和教育不无关系，他的确是该收敛一些了。

图1 Cuff套管技术建立小鼠下腔静脉-颈动脉移植模型

Fig.1 Using the cuff casing technology establish inferior vena cava-carotid artery transplantation model in mice

注:图A和B示小鼠下腔静脉移植至颈动脉,B图中箭头所示吻合结束后,静脉血管桥充盈良好。图C为Cuff套管技术下腔静脉-颈动脉移植示意图

  

图2 基因型鉴定示意图

 

Fig.2 Genetic identification schematic

2.2 观察两组小鼠静脉桥内膜增生

通过表2、3所侧数值可以看出:(1)在静脉移植术后8h,CatS(-/-)组和C57BL/6组MMP-9含量表达分别为4.32±0.07ng/mL和4.38±0.05ng/mL,两组之间比较,差异无统计学意义;(2)从术后1d开始,两组数据行t检验分析比较,P<0.05,差异有统计学意义;(3)从术后第3d开始至术后2wk,我们发现MMP-9含量表达在C57BL/6小鼠中较CatS(-/-)组明显增多,尤以术后2wk最为明显;(4)术后4wk,两组MMP-9含量表达分别为3.10±0.09ng/mL和3.62±0.24ng/mL,从数值我们可以看出,虽然其含量表达较前明显减少,但两组之间比较仍有差异;(5)移植术后2wk,MMP-9含量表达在CatS(-/-)组和C57BL/6组差异显示较为明显,分别为6.12±0.11ng/mL和9.23±0.12ng/mL,P<0.05,差异有统计学意义。

  

图3 术后8h内膜情况(CatS-/-组,HE×200)

 

Fig.3 8h after surgery

 

 

图4 术后8h内膜情况(C57BL/6,HE×200)

 

Fig.4 8h after surgery

2.3 两组小鼠静脉桥MMP-9含量表达(见表2，3)

表2 两组小鼠MMP-9含量表达结果

Tab.2 Compare the expression of mmp-9 in

  

组别8h(ng/mL)1d(ng/mL)3d(ng/mL)CatS(-/-)4.32±0.074.36±0.134.78±0.11C57BL/64.38±0.054.57±0.095.24±0.20

表3 两组小鼠MMP-9含量表达结果

Tab.3 Compare the expression of mmp-9 in

  

组别7d(ng/mL)14d(ng/mL)28d(ng/mL)CatS(-/-)5.73±0.066.12±0.113.10±0.09C57BL/68.30±0.269.23±0.123.62±0.24

图5 术后7d内膜情况(CatS-/-组,HE×200)

Fig.5 7days after surgery

图6 术后7d内膜情况(C57BL/6组,HE×200)

Fig.6 7days after surgery

图7 术后28d内膜情况(CatS-/-组,HE×200)

Fig.7 28days after surgery

图8 术后28d内膜情况(C57BL/6组,HE×200)

Fig.8 28days after surgery

显微镜下观察两组小鼠移植静脉桥术后不同时间点(8h、1d、3d、7d、14d、28d)血管内膜发现:在术后8h,内膜增生在两组之间无显著差别,随着术后时间的推移,对照组(C57BL/6组)小鼠内膜逐步增生,且变化较为明显,而实验组(CatS基因敲除组)内膜虽也有增生,但其增生程度较对照组明显减轻(见图3～8)。

在发达和发展中国家导致发病率和死亡率的主要原因以心血管病最为显著[5],有数据显示:冠心病在众多心脏猝死的病因中占据80%以上[6],对老年人个体化健康教育可在一定程度上提高冠心病病人的生活治疗[7]。对于外科而言,自体静脉移植术是治疗冠心病的主要方法,但在静脉移植过程中会导致内皮受损和剥离,导致正常内皮细胞所产生的血管保护因子丢失。有研究证实冠状动脉旁路移植术后早期应用t-PA,能有效预防大隐静脉血管桥的早期再狭窄,方法简便易行,值得推广应用[8];另有学者认为地塞米松可抑制局部炎症反应和血管平滑肌细胞的增殖,促进血管平滑肌细胞的凋亡,从而防止再狭窄的静脉移植[9]。

3 讨论

不久前，美国能源部能源效率与可再生能源办公室决定投入1450万美元研究经费，聚焦地热钻井技术，促进地热能源技术创新，加快地热产业的发展。

鼠尾DNA分别与CatS(-/-)和C57BL/6的引物(见表1)进行PCR。在150bp 片段处,只产生CatS-/-引物的带为CatS基因敲除的纯合小鼠,只产生C57BL/6引物的带为C57BL/6小鼠,CatS-/-引物和C57BL/6引物两条带都产生的是CatS杂合小鼠(见图2)

3.1 CatS基因缺失与血管内膜增生、MMP-9含量关系

目前各种基因疗法在不同的动物模型试验中已被普遍的研究。然而,只有“E2F”诱导策略已在临床试验中得到评估。转录因子“E2F”是负责与细胞周期调控相关的基因表达[11],在家兔和人的静脉段实验研究中已被证实:诱导治疗可在很大程度上抑制SMC增殖,保护内皮细胞的功能,并限制动脉粥样硬化的进行性发展,显著降低内膜增生[12,13]。这些令人兴奋的数据只导致了一系列的临床试验,它们通过基因转染体外静脉移植工程试验来证实上述观点。“E2F”诱导基因传递策略的安全和生物有效性在41名病人中被证实[14]。然而,在临床上,基因治疗还未真正应用。

MMP-9可被多种细胞所分泌,包括中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等,并具有多种生物学功能。它在心血管疾病中具有一定的调节作用,有研究报道:MMP-9在很多心血管疾病中,如原发性或继发性高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死等疾病中含量表达增多[10]。而MMP-9的缺失或被抑制在许多心血管疾病动物模型中已被认为是有益的,我们试验中得出的结论也是如此,MMP-9的表达在CatS(-/-)组较C57BL/6小鼠组明显减少,尤其是在术后2wk,CatS(-/-)组和C57BL/6组MMP-9含量表达分别为6.12±0.11ng/mL和9.23±0.12ng/mL,从上面数据我们可以看出,差异非常明显,说明MMP-9的含量与CatS基因是否存在有一定的联系,当CatS基因敲除以后,其含量表达减少,血管再狭窄程度减轻。

3.2 基因治疗静脉桥再狭窄应用临床所面临的挑战

血管狭窄特征性的组织学特点是内膜的增生,这是一个非常复杂的过程,而平滑肌细胞的增殖和迁移在内膜增生的过程中起到了关键作用。本研究结果中通过镜下观察小鼠移植静脉的内膜增生,可看出随着时间推移,CatS(-/-)组内膜增生较C57BL/6组明显减轻。

首先,实验研究前临床评估很重要,动物模型建立的最终目的是为了临床,许多的实验研究评估了内膜增生这一要点,但是这可能不是最有临床意义的。其次,虽然各种动物模型在总体和组织学水平上对静脉桥再狭窄的发病机制做了概括[15],但在人体的发病机制还需进一步探讨,以确定在哪种动物模型能更好的代表这些分子机制。例如,在小鼠静脉桥移植模型中,虽然有丰富的炎症途径的数据,但是在人类和小鼠之间其炎性细胞因子,黏附分子和受体的细胞表达模式的还是有着很大的差异[16]。虽然试验研究还并没有应用于临床,但其在某些方面证实了基因治疗应用于静脉桥再狭窄中是可行和安全的。近期有研究证实CD133过量表达可在早期证实再移植静脉血管发生闭塞的可能性[17]。

4 结论

本实验利用Cuff套管技术建立小鼠下腔静脉-颈动脉移植模型,抓住了再狭窄启动的关键-活化的巨噬细胞,通过显微镜观察血管内膜增生证实了CatS基因敲除在一定程度上可对静脉桥再狭窄产生抑制作用。通过测定小鼠移植血管桥中MMP-9含量,证实了CatS基因敲除后,MMP-9表达下降,抑制了内皮细胞及VSMC增殖反应,ECM沉积,进而减轻了静脉桥血管再狭窄的程度,为CABG后静脉桥再狭窄的防治提供实验依据。

3.恐龙化石。二连浩特是亚洲最早发现恐龙及恐龙蛋化石的地区之一，是世界最大的白垩纪恐龙化石埋藏地，境内拥有134平方公里国家级地质公园。近百年来，先后有俄、美、瑞典、加拿大、日本、比利时、意大利等国的古生物学家来二连进行科学考察，发现了大量的恐龙化石，取得了重要研究成果。二连盆地的恐龙化石生物群是晚白垩纪恐龙生物群的代表，恐龙化石种类多、分布广、保存完好，反映了晚白垩纪恐龙生物群的主要特征。这些恐龙化石虽然不能直接产生经济效益，但是作为一份来自远古历史的礼物它们成为了二连浩特一张独特的名片，吸引着世界范围内游客的目光，这真是一种取之不尽、用之不竭、绿色生态可持续的经济产业。

参考文献

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