骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见老年性多发疾病，发病部位常见于膝关节，表现为疼痛、肿胀、活动受限等，严重影响患者生活质量［1］。OA在中医学上属“痹证”范畴，以肝肾亏虚为病变根本，风寒湿邪是其致痹外因，病机总属本虚标实、本痿标痹［2-3］。电针作为传统针灸疗法与现代电疗结合产物，具有舒经活络、行气活血、消炎镇痛之效，对防治OA具有良好疗效［4-5］。前期研究表明：电针具有抑制软骨细胞凋亡、延缓OA关节软骨退变、促进关节软骨修复的作用［6-8］。本实验拟观察电针刺激大鼠内外膝眼一定时间后获得的血清（电针后血清）对TNFα诱导的大鼠体外软骨细胞凋亡模型的影响，并检测其 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达情况，从而进一步阐明电针防治OA的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 2月龄SD雄性大鼠30只、4周龄SD雄性大鼠12只购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。实验动物饲养于福建中医药大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK（闽）2014-0005，分笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养。

1.2 实验试剂 磷酸盐缓冲液（PBS）、低糖型DMEM培养基、胎牛血清、二型胶原酶、0.25%胰蛋白酶（美国 Hyclone公司）；肿瘤坏死因子 α（TNFα，美国Sigma 公司）；Annexin V-FITC／PI凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；逆转录试剂盒（日本TAKARA公司）；PCR引物 （上海铂尚生物技术有限公司）；诺唯赞qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器 华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪、华佗牌一次性不锈毫针，规格：13 mm×0.25 mm（苏州医疗用品厂有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术公司）；CO2培养箱（香港力康生物医疗科技控股有限公司）；相差倒置显微镜、荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；PCR仪 （美国 Applied Biosystems公司）；7500 Fast型荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

(2)复合缓蚀阻垢剂的最优配比实验。在总质量浓度240 mg/L不变的条件下进行最优配比实验，缓蚀剂和阻垢剂质量浓度见表3。在60℃、常压条件下对不同配比的复合缓蚀阻垢剂的性能进行测试。

目前，我国规范金融业务的法律法规主要是针对传统金融业务制订的，而互联网金融业务出现后，没有对原有金融方面的法律进行调整。我国对各类互联网金融公司的属性没有明确的确定，并且也没有规范互联网金融业务的法律法规，以致于互联网金融业务缺乏法律保护。一些不法分子，利用互联网金融的法律缺失，通过互联网金融理财平台进行非法吸收社会公众资金、洗钱、出卖客户信息等违法行为。

2 实验方法

2.1 血清制备 2月龄SD雄性大鼠30只，应用随机数字表法分为正常组（n＝10）、电针15 min组（n＝10）和电针 30 min 组（n＝10）。 正常组常规饲养，电针15 min组和电针30 min组分别予电针刺激大鼠双侧膝关节内、外膝眼，刺激时间分别为每次15 min、30 min，每天 1次，连续干预 1周。1周后，大鼠在麻醉状态下行腹主动脉采血，经离心获取正常组、电针15 min组和电针30 min组血清，于56℃水浴灭活30 min及过滤除菌后，-20℃保存，细胞实验时用DMEM配制为10%浓度进行干预。

1.4 导管护理 合理安排各项护理操作，建立温馨的恢复环境，保持病房安静、整洁。保证充足的睡眠，减少疼痛等不良刺激;妥善固定胃管，采用“Y”型宽胶布鼻梁固定胃管，顺应胃管置入方向，呈自然状态，观察并记录置入胃管的深度;严格执行护理技术操作规程，在搬运、翻身、拍背和口腔护理等操作时注意防护，必要时2名护士合作。对患者和家属进行导管自我护理宣教，并给予患者心理支持。护士通过临床观察提示患者有意识改变时进行约束，同时告知医师，分析原因，制定个体化护理措施。

2.2 软骨细胞提取与培养 采用2%戊巴比妥钠麻醉4周龄SD大鼠，每次4只，分3批次提取软骨细胞。用剪刀离断并取出双膝关节，在洁净台上，分离、切取双膝软骨，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小后，用4 mL 2%Ⅱ型胶原酶于37℃培养箱消化2 h；消化后，收集上清液于15 mL离心管中，以1 000 rpm的速度离心5 min获得软骨细胞；用4 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬软骨细胞沉淀，并接种25 cm3培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。上述步骤重复4次。于倒置显微镜下观察细胞每日生长情况，待细胞长满至85%～90%后传代培养，每隔48 h后更换培养液。以2代软骨细胞为实验对象，调整细胞密度为 1×105个／mL，取 2 mL接种于六孔板中，培养72 h后进行实验。

2.4.1 软骨细胞凋亡率 干预软骨细胞后，用移液枪吸弃培养液，PBS清洗1次，吸弃PBS，用不含EDTA的胰酶消化软骨细胞，收集于流式管中，2 000 rpm离心5 min，调整细胞密度为1～5×105个／mL。流式管每管加入500 μL Binding Buffer重悬软骨细胞，再加入FITC和PI各5 μL，混匀并于室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测各组软骨细胞凋亡率。

2.4 检测指标

2.3 软骨细胞干预方法 参考文献［9］，采用10 ng／mL TNFα诱导软骨细胞凋亡。将第2代软骨细胞随机分为正常组、模型组、电针15 min组和电针30 min组。正常组予正常组血清2 mL干预，模型组予含10 ng／mL TNFα正常组血清2 mL干预，电针15 min组予含10 ng／mL TNFα电针15 min组血清2 mL干预，电针 30 min组予含10 ng／mL TNFα电针30 min组血清2 mL干预。各组同时进行干预，干预48 h后检测相应指标。

橘红回信了！真的回信了！橘红会在信里骂我吗？橘红过得好吗？肯定好不了。是你何牦这没用的男人，让橘红受尽了委屈，受尽了折磨，受尽了苦难，她的日子能过得好吗？何牦，何牦，你再也不能让橘红受苦受难了，哪怕是做牛做马，也要使橘红过上好日子。

表1 引物序列表

引物β-actin ERK1／2 C-Myc C-Fos C-Jun上游序列5'-ACCACTGGCATTGTGATGGA-3'5'-CATTCCTGGTCAAGAGCAAGAAG-3'5'-CTATCACCAGCAACAGCAGAG-3'5'-CTGTGACCTCCCTGGACTTG-3'5'-TTCTACGACGATGCCCTCAAC-3'下游序列5'-CGCTCGGTCAGGATCTTCT-3'5'-GTCTGGAGCCTCGGTAAGC-3'5'-CATAGGACGGAGAGCAGAGC-3'5'-CCATGTTGCTAATGTTCTTGACC-3'5'-AGGTTCAAGGTCATGCTCTGC-3'

实验反应分为三个阶段：预热阶段为95℃3 min； 循环阶段为 95℃ 10 s、60℃ 30 s， 循环 40次；溶解曲线阶段为 95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s。实验结束后，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

2.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件统计分析。计量资料属正态分布的以（x±s）表示，采用t检验；不符合正态分布采用非参数检验。

2.4.2 软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达 如2.3干预软骨细胞后，用Trizol法提取各组软骨细胞总RNA，取1 μg RNA按照TAKARA逆转录试剂盒使用说明书逆转录成cDNA。按照诺唯赞qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒说明书进行操作，以各组cDNA为模板行实时荧光定量PCR检测，β-actin为内参，具体引物序列如下：

3 实验结果

3.1 软骨细胞形态观察 刚提取的软骨细胞 （即原代软骨细胞）悬浮于培养液中（图1A），原代软骨细胞培养24 h后开始贴壁，培养48 h可见软骨细胞成簇现象（图1B），以梭形或椭圆形生长。细胞数量较多时，可呈典型的“铺路石”状。第1代及第2代软骨细胞状态良好，细胞的增殖速度较快，增殖及分泌基质的能力较强，其中第2代软骨细胞较为纯化，更适合作为实验对象（图1C、图1D）。

3.2 各组软骨细胞凋亡率 电针后血清对TNFα诱导软骨细胞凋亡的影响如图2所示，正常组凋亡率为（6.22±0.13）%，模型组凋亡率为（26.49±0.79）%，2组比较有显著性差异 （P＜0.05）。 电针15 min组凋亡率为（16.81±1.71）%，电针 30 min组凋亡率为（13.88±0.83）%，2组与模型组比较均有显著性差异（P均＜0.05）。

图1 软骨细胞形态观察（×100）

3.3 软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达与正常组比较，模型组在 Erk1 ／2、C-Myc、CFos、C-Jun 表达均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针 15 min组与电针 30 min组的 Erk1／2、CMyc、C-Fos、C-Jun基因表达均显著降低（P均＜0.05）。 见表 2、图 3。

4 讨 论

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proyein kinases，MAPKs）信号转导通路存在于大多细胞内，

图2 各组软骨细胞凋亡情况

图3 各组软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun基因表达情况

表 2 各组软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表达结果（x±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别正常组模型组电针15 min组电针30 min组Erk1／2 1.00±0.00 1.95±0.171）1.73±0.102）1.45±0.282）C-Myc 1.01±0.01 1.40±0.051）1.25±0.072）1.14±0.092）C-Fos 1.00±0.02 2.60±0.241）1.25±0.362）1.14±0.232）C-Jun 1.00±0.01 1.78±0.041）1.32±0.172）1.17±0.072）

其将细胞外刺激转导至细胞及其核内，引起细胞增殖、分化、凋亡等生物学反应。目前，在哺乳类细胞已发现存在着 ERK通路、JNK／SAPK通路、P38 MAPK通路三条并行的MAPKs信号通路。近年来，ERK通路（即Ras-Raf-MEK-ERK信号连级通路）的细胞生物学作用越来越受到重视，有学者认为ERK通路表达上调一方面能促进软骨细胞增殖，形成明显骨赘，另一方面可能会加快软骨细胞凋亡，引起细胞结构破坏、细胞外基质降解［10-11］。该信号通路可被多种细胞外刺激信号激活，激活的Erk1／2进一步促使C-Myc、C-Fos、C-Jun转录因子磷酸化来调节基因表达，进而参与调节细胞增殖、分化和凋亡［12-13］。 相关研究表明：C-Myc、C-Fos、C-Jun 参与多种细胞凋亡活动［14-17］。此外有研究显示：TNFα能激活Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，促进IL-1β表达，提高MMPs活性，并与激活产物进一步发生协同作用，促使细胞外基质降解、软骨细胞凋亡［18-20］。

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开展水利工程的生态影响评价，制定评价系统的指标体系和方法，对水利工程生态效应的科学性、统一性进行评估。大多的水利工程生态环境影响评价仍以定性评价为主，缺乏定量的、科学统一的评估方式。在制定评价体系时，应做到定性与定量结合研究，定性分析需要以现状调查为基础，从水生生态系统现有物种的种类、组成、结构和功能，预测水利工程建设后对生物群落在组成、数量、结构等方面的影响。定量评估需确定水利工程生态影响程度和经济效益大小，制定统一的、科学的、具有代表性的指标体系、评价标准和评价方法，使不同水利工程生态影响的评价结果具有科学性和可比性。

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⑤多类信息叠加应用。系统实现了在GIS地图上卫星云图、实况雨量、气温和热带气旋路径等多类水文气象信息以图层形式叠加显示应用，用户可以通过业务图层数据显示控制面板，灵活控制每一类数据的显示和消隐，满足用户综合分析应用水文气象各类信息的需要。

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译文：因为维诺娜的至尊十字架到哈德良长城与到怀特岛距离相等，所以罗马人把该处视为英国的中心。（先因后果）

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在区分高、低自尊者的基础上，研究者进行了两方面的比较，一方面是进行了三组中高自尊者及低自尊者职业认同的组间比较； 另一方面是分别对三组中同一组的高自尊和低自尊者职业认同进行了组内比较。

本实验结果显示：TNFα诱导的大鼠凋亡软骨细胞经其电针后血清干预后，细胞凋亡率明显下降，各组软骨细胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 的基因表达显著降低，表明大鼠电针后血清能有效抑制TNFα诱导的软骨细胞凋亡，其机制可能与下调Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因的表达有关。

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对83例胃癌患者的性别，肿瘤的位置、直径、Borrmann分型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和远处转移，以及新辅助化疗和 CTC阳性等指标，进行COX单因素和多因素回归分析。结果发现，胃癌患者术后生存的独立影响因素为肿瘤分化程度、新辅助化疗和 CTC阳性这3项指标（P值分别为0.035、0.011和＜0.001，表2和表3）。

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早期的隐喻研究多数停留在对静态语篇的语言表征进行分析，主要集中在小说等文本语篇、平面广告、静态漫画等的文本分析，如Forcevill(1996)在Pictorial Metaphor in Advertising一书中首次从认知的角度对平面广告中图像隐喻进行了全面系统的阐述。随着现代技术的发展，多模态研究逐渐拓展到视、听等多种动态模态符号，如电视广告、电视音乐等。

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