糖尿病(diabetes mellitus，DM)是以血糖水平增高为特征的代谢性疾病，患者空腹时血糖高于正常人，进餐后血糖高峰值高于正常人，血糖升高持续时间比正常人显著延长，长期高血糖状态可引起冠心病、肾病、视网膜病变和大血管疾病等并发症[1]，餐后高血糖是引起各种并发症的主要原因。餐后血糖的升高是由于食物中的碳水化合物在淀粉酶和α-葡萄糖苷酶作用下，生成葡萄糖和果糖被小肠吸收后进入血液循环引起的[2,3]，因此ɑ-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是调节食物来源血糖的关键酶，成为调控餐后血糖药物的重要靶标。α-葡萄糖苷酶及淀粉酶抑制剂可有效抑制进食后葡萄糖的生成，降低餐后血糖峰值，从而有效预防糖尿病并发症的发生和发展[4]。目前已上市的α-葡萄糖苷酶及淀粉酶抑制剂主要有伏格列波糖、阿卡波糖和米格列醇[5]，这些药物作为治疗2型糖尿病的首选药已取得了较好的疗效，但这3种药物均属于糖类物质，到达大肠后会引起腹部不适、胀气、排气等不良反应[6,7]。为了尽可能地减少药物副作用，实现药物品种的多样化，开发新的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有重要意义。传统中药民族药在降血糖及防治糖尿病中具有较好的效果，是研究新型α-葡萄糖苷酶及淀粉酶抑制剂的重要资源[8]。姜黄(Curcuma longa L)为姜科姜黄属植物，性温，味辛、苦，归脾、肝经，具有通经止痛、破血行气、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[9]。姜黄的主要有效成分为姜黄素类化合物和挥发油，后者主要含有芳姜黄酮、姜烯、姜黄烯、芳姜黄烯等20余种倍半萜类化合物[10]。在前期研究中，利用芳姜二烯酮与吲哚类化合物进行反应获得了3个芳姜黄酮衍生物PY-2-17、PY-2-28、PY-2-33(见图1)，本研究拟针对这3个衍生物及其母体芳姜黄酮化合物的抗α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶活性进行研究，以期为芳姜黄酮的应用开发提供参考和依据。

  

PY-2-17 PY-2-28 PY-2-33图1 芳姜黄酮3种衍生物的结构式Fig.1 The chemical structure of three derivatives of ar-turmerone

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 芳姜二烯酮类衍生物(含PY-2-17、PY-2-28、PY-2-33，纯度95%)由贵州大学药学院周英课题组提供，4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、α-葡萄糖苷酶和二甲亚砜 (DMSO) 购自于美国Sigma公司，α-淀粉酶、可溶性淀粉购自于北京索莱宝科技有限公司。芳姜黄酮标准品购自于上海江莱生物科技有限公司，磷酸盐缓冲液粉末购买于北京鼎国生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯。

2.1 病原菌分布 7548份标本中共分离株病原菌2539株，阳性率33.64%；其中革兰阴性菌994株，占39.15%，革兰阳性菌1015株，占39.98%，真菌530株，占 20.88%；见表1。

1.1.2 仪器与设备 电热恒温培养箱(DNP-9082型，上海精宏实验设备有限公司)，pH计(H1 3221 pH Meter HANNA)，可见紫外分光光度计(UV-2550，日本岛津公司)，制冰机(SCOTSMAN AF 100)，精密电子天平(METTLER TOLEDO AL104梅特勒-托利多仪器有限公司)，全自动酶标仪(美国GENE公司，SYNERGY 2)。

从短期来看，不同年级、不同专业的学生所需要的职业规划和就业指导是不同的。比如，大一学生更注重兴趣和专业技能的培养，通过科学的职能能力测评可初步确定今后的就业目标，从而开展有针对性的就业指导。而大三大四的学生除了已经具备相关的专业技能外，学校应提供更多的就业信息、面试方法、创业方面的政策法规和技巧等，从而针对不同阶段的学生进行针对性的就业指导。从长远来看，高校应将大学生职业生涯规划纳入学科发展体系，并针对不同学生开展针对性的教学指导。

1.1.3 药物的配制 将购买的磷酸盐缓冲液粉末配制成0.4 mol/L、pH 6.8的溶液，储存在4 ℃冰箱备用。底物PNPG的配制：分别利用磷酸盐缓冲液配成1.0、2.0、4.0、8.0 g/L的底物溶液，漩涡混合均匀，用封口膜封口保存在-20 ℃冰箱备用。α-葡萄糖苷酶：利用磷酸盐缓冲液配成0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，用封口膜封口保存在-20 ℃冰箱备用。α-淀粉酶：利用超纯水配成淀粉酶溶液(4 g/L)，用封口膜封口保存在4 ℃冰箱备用。可溶性淀粉溶液：利用超纯水配成0.5%的淀粉溶液，用封口膜封口保存在4 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.2 芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制类型 改变底物PNPG的浓度，根据米氏方程的双倒数作图法计算米氏常数(Km)及最大反应速率(Vmax)的变化，确定药物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制类型。反应体系同样为80 μL(表1)，分别将PNPG配制成4个不同的浓度，以加入相同体积的底物以确保底物的终浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0 g/L。分别检测终浓度为0、0.8、1.6 g/L芳姜黄酮及其衍生物作用下0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶对不同浓度底物的催化反应速率，分别计算Km及Vmax，判断其抑制类型。

 

表1 芳姜黄酮及其衍生物的抗α-葡萄糖苷酶活性的反应体系(μL)Tab.1 System for detection of the inhibitory effect of ar-turmerone and its derivatives on the activity of α-glucosidase

  

试剂 实验组对照组阳性组阴性组PBS(1)-20-20芳姜黄酮及其衍生物20-20-PNPG40404040α-葡萄糖苷酶2020用PBS代替用PBS代替

(1)PBS为磷酸盐缓冲液，“-”为未加

1.2.1 芳姜黄酮及其衍生物的抗α-葡萄糖苷酶活性 参照96孔板法[7]，测定终浓度为1.2 g/L的芳姜黄酮及其衍生物在不同作用时间(0、5、10、15、20、25、30 min)对0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶催化4.0 g/L PNPG水解的活性的影响。反应体系按照表1进行，运用酶标仪分别在不同作用时间检测405 nm波长的OD值，按照公式(1)和(2)计算其抑制率，得到时间抑制曲线，获得最佳反应时间并确定这些药物对酶活性的抑制是否具有时间依赖性。抑制率(%)=(A对照-ASample)/A对照×100%(1),ASample=A2-A1(2),A1、A2分别为添加α-葡萄糖苷酶前后的OD值。用96孔法测定不同浓度芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果：将芳姜黄酮及其衍生物配制成不同浓度，总反应体系为80 μL，芳姜黄酮及其衍生物的终浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L，以便在反应体系中加入相同体积的底物。α-葡萄糖苷酶的浓度为0.2 U/mL，PNPG的浓度4.0 g/L，反应时间为20 min，反应体系按照表1进行。

在体外检测了芳姜黄酮衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的影响见图2，结果表明芳姜黄酮及其衍生物能够较好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。如图2，在此范围内随着芳姜黄酮及其衍生物浓度升高，抑制作用逐渐增加，显示出剂量依赖关系，但衍生物PY-2-28、PY-2-33与母体芳姜黄酮的抑制活性低于阳性对照阿卡波糖，而衍生物PY-2-17的抑制活性与阿卡波糖接近。检测不同作用时间对其活性的抑制作用，结果如图2，芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用在15～20 min以后，其抑制活性随时间增加不明显，表明芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用与作用时间有关，在15～20 min达到最大。

 

表2 芳姜黄酮及其衍生物抗α-淀粉酶活性的反应体系 (mL)Tab.2 System for detection of the inhibitory effect of ar-turmerone and its derivatives on the activity of α-amylase

  

反应体系 α-淀粉酶液芳姜黄酮及衍生物淀粉DNS对照管 0.1-0.21实验管 0.10.10.21背景对照管-0.10.21

注：“-”为未加

2 结果

2.1 芳姜黄酮衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的影响

1.2.3 芳姜黄酮及其衍生物的抗α-淀粉酶活性 根据Udupa等[7]的方法，各个浓度(终浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 g/L)芳姜黄酮及其衍生物溶液100 μL与淀粉酶溶液100 μL(5 g/L)在室温下预混合15 min后，加入0.5 g/L可溶性淀粉溶液200 μL起始反应，反应混合液于37 ℃反应10 min后，加入二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid solution，DNS)溶液1 mL终止反应，见表2。反应液置沸水浴中不同时间(0、5、10、15、20、25和30 min)后于冰水浴中迅速冷却，加蒸馏水3 mL稀释后测定540 nm处OD值，同时做样品对照。抑制剂对α-淀粉酶的抑制率按公式(3)和(4)计算。抑制率(%)=(1-A0/A1)×100%(3)，A0=A2-A3(4)，式中A1、A2、A3分别为540 nm处对照管、实验管和背景对照管的OD值。同样采用Udupa等的方法，0.8 g/L的芳姜黄酮及其衍生物100 μL与淀粉酶溶液100 μL(5 g/L)在室温下预混合15 min后，加入0.5 g/L可溶性淀粉溶液200 μL起始反应，反应混合液于37 ℃反应10 min后，加入DNS试剂1 mL终止反应，将反应液置沸水浴中不同时间(0、5、10、15、20、25和30 min)后于冰水浴中迅速冷却，加3 mL蒸馏水稀释后，运用酶标仪分别检测不同浓度时在540 nm波长处的OD值。设置对照组，各组试剂及剂量见表2。重复有效实验3次，取平均值，按照公式(3)和公式(4)计算其抑制率，得到时间抑制曲线，并确定芳姜黄酮及其衍生物对α-淀粉酶活性的抑制是否具有时间依赖性。

2.2 芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的影响方式

米氏方程的双倒数作图法得到的结果表明(图3)，不同浓度芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性作用下，Vmax值几乎相等，而Km值随着浓度的增加逐渐增大，表明芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制属于竞争性抑制。

  

图2 芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of ar-turmerone and its derivatives on the activity of α-glucosidase

  

注：A～E分别表示在芳姜黄酮衍生物作用下，a-葡萄糖苷酶对不同浓度(终浓度分别为0、1.0、2.0、4.0和8.0 g/L)底物的催化反应速率图3 芳姜黄酮衍生物抑制α-葡萄糖苷酶活性Fig.3 Inhibitory effect of ar-turmerone and its derivatives on α-glucosidase

2.3 PY-2-17、PY-2-33和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力

在体外进行芳姜黄酮及其衍生物对α-淀粉酶活性影响实验，检测各化合物在不同浓度下对其活性的抑制作用。结果如图5，表明母体芳姜黄酮及其芳姜黄酮衍生物均能够较好的抑制α-淀粉酶活性，且在一定范围内随着浓度升高，抑制作用逐渐增加，显示出剂量依赖关系，但其浓度在1.2 g/L以上时，对α-淀粉酶的抑制作用增长缓慢。对比发现其抑制活性均低于阳性对照阿卡波糖。检测各化合物在不同作用时间下对α-淀粉酶活性的抑制作用，结果如图5，发现芳姜黄酮及其衍生物对α-淀粉酶活性的抑制作用均在反应时间为15 min时达到峰值，15 min以后其抑制作用随时间推移而逐渐减弱，在20 min以后随时间变化其抑制作用无明显变化。表明芳姜黄酮及其衍生物对α-淀粉酶活性的抑制作用与反应时间有关。

  

注：A～E分别表示在不同浓度(终浓度分别为0、0.4、0.8、1.2和1.6 g/L)芳姜黄酮衍生物作用下，a-葡萄糖苷酶对底物的催化反应速率图4 芳姜黄酮衍生物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力Fig.4 The inhibitory ability of ar-turmerone, its derivatives and acarbose on α-glucosidase enzyme action

2.4 芳姜黄酮及其衍生物对α-淀粉酶活性的影响

使用不同浓度的PY-2-17、PY-2-33和阿卡波糖进行了α-葡萄糖苷酶活性抑制实验，经计算，PY-2-17和PY-2-33的IC50值分别为0.397 g/L和0.314 g/L，已知阿卡波糖的IC50值为0.57 g/L，说明化合物PY-2-17和PY-2-33对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力强于阿卡波糖。见图4。

  

图5 芳姜黄酮及其衍生物对α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of ar-turmerone and its derivatives on the activity of α-amylase

3 讨论

姜黄为姜科(Zingiberaceae)姜黄属植物姜黄(Curcuma longa L.)的干燥根茎，作为传统中药材被收纳于《中华人民共和国药典》中[11]。姜黄素、姜黄挥发油为姜黄的主要天然活性成分，近年来在降糖方面的研究已成为热点。发现姜黄素可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路发挥降糖作用[12]，通过抑制JNK和p38途径减弱胰岛素抵抗[13]，通过调节肿瘤坏死因子α、核因子κB、游离脂肪酸、脂质过氧化和溶酶体酶使血糖水平正常化[14]。P. C. Lekshmia等[15]研究发现姜黄挥发油能比参考药物阿卡波糖更有效地抑制α-葡萄糖苷酶，并且干燥根茎中提取的姜黄挥发油对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力更强，分别为IC50=1.32-0.38 μg/ml和IC50=64.7-34.3 μg/mL。

菊花是多年生的宿根花卉，株高在60～100cm之间，全株被毛。其茎直立，基部半木质化，有粗糙感。其叶呈卵形或披针形，边缘有深裂或粗大锯齿，根部呈楔形。菊花是头状花冠，直径为2.5～20cm，外轮舌状花有很多种类，花色多样，有白、黄、紫、红、灰、绿等色以及间色等品种，花期在8～12月之间，8～9月开花的为早菊，11月开花的为中菊，晚菊12月开花。其果瘦，种子一般不育。

主题——人必须尊重大自然，狂妄地侵犯大自然，终究为自己带来灾难，而那趟恐怖起落的云霄飞车旅程，正是某种“灾难体验”。搭迪士尼的云霄飞车，不只是搭云霄飞车，更是走进一个故事，体验故事，并可以借故事来转述自己在列车上的感受。不会一开口只能说：“好高好快好刺激”，就不知道还能再讲什么了。

芳姜黄酮为姜黄挥发油的主要活性成分，本研究中，利用α-葡萄糖苷酶可水解底物PNPG，α-淀粉酶可水解底物可溶性淀粉溶液，并以一定时间内反应体系中反应物含量的变化来计算芳姜黄酮及其衍生物对α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的抑制作用。发现芳姜黄酮及其衍生物能够抑制ɑ-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，且对ɑ-葡萄糖苷酶活性为竞争性抑制，意味着这些化合物可与底物竞争性结合α-葡萄糖苷酶的酶活中心，从而阻碍酶与底物结合。另外，芳姜黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果低于阳性参照药物阿卡波糖，而衍生物PY-2-17和PY-2-33对其的抑制能力显著高于阿卡波糖。本研究结果为获得经济、安全、有效的ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂奠定了理论基础。

4 参考文献

[1] 刘瑞丽，丁美萍，徐雯，等. α-葡萄糖苷酶抑制剂研究进展[J]. 药物生物技术，2009，16(4)：388-392.

[2] 顾觉奋，陈紫娟. α-葡萄糖苷酶的研究及应用[J]. 药学进展，2009，33(2)：62-67.

[3] TIWARI A K，KUMBHARE R M，AGAWANE S B，et al. Reduction in post-prandial hyperglycemic excursion through α-glucosidase inhibition by β-acetamido carbonyl compounds[J]. Bioorganic & medicinal chemistry letters，2008，18(14)：4130-4132.

[4] 杨光，李春霖. α-糖苷酶抑制剂在糖尿病患者中的应用[J]. 中国药物应用与监测，2007，4(1)：16-20.

[5] 李玉萍，白冰，叶军，等. α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备和活性研究进展[J]. 食品科学，2008，29(9)：617-620.

[6] SHOBANA S，SREERAMA Y N，MALLESHI N G. Composition and enzyme inhibitory properties of finger millet (Eleusine coracana L) seed coat phenolics: Mode of inhibition of α-glucosidase and pancreatic amylase[J]. Food Chemistry，2009，115(4)：1268-1273.

[7] MURAI A，IWAMURA K，TAKADA M，et al. Control of postprandial hyperglycaemia by galactosyl maltobionolactone and its novel anti-amylase effect in mice[J]. Life sciences，2002，71(12)：1405-1415.

[8] 季芳，肖国春，董莉，等. 药用植物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂研究进展[J]. 中国中药杂志，2010，35(12)：1633-1640.

[9] 庞邦斌，银胜高，黄云兰，等. 不同产地姜黄药材的质量研究[J]. 华西药学杂志，2014，29(3)：308-310.

[10]耿娓琴，陈钟瑛，严秉淳. 芳姜黄酮和姜烯衍生物的合成及抗生育活性初探[J]. 华东化工学院学报，1990(1)：61-67.

[11]魏文文，吴萍，潘武，等. 姜黄地上部分化学成分的研究[J]. 热带亚热带植物学报，2017，25(1)：87-92.

[12]盛勤，王艳秀，陈家宝，等. 基于AMPK信号通路的中药降糖作用的研究进展[J]. 中国药师，2017，20(12)：2225-2228.

[13]GENG S，WANG S，ZHU W，et al. Curcumin attenuates BPA-induced insulin resistance in HepG2 cells through suppression of JNK/p38 pathways[J]. Toxicology Letters，2017，272(1)：75-83.

[14]ADEEB S，SALMAN U I，YOUNG S L. Therapeutic role of curcumin in the prevention and treatment of diabetes and hypertension[J]. Phytotherapy in the Management of Diabetes and Hypertension，2016，36(2)154-174.

[15]LEKSHMI P C，ARIMBOOR R，INDULEKHA P S，et al. Turmeric (Curcuma longa L.) volatile oil inhibits key enzymes linked to type 2 diabetes[J]. Int J Food Sci Nutr，2012，63(7)：832-834.